滚环扩增原理及方法

三维滚滑 害怕吗？你敢坐吗？敢坐吗？啊？敢不敢坐？看看三杯滚花。特别害怕啊。看着啊， 要启动了 要启动了。 我去。 哎呀哇， 不行了，我哭了。小伙子 能玩吗？ 我也不敢 哦， 要下来了。看他什么表情呦。 怎么样啊怎么样？真的很酷很酷。你要去吗？ 不去。是吗？害怕吗？等我长长到长到那个二十岁我才去。长一米四就可以去了啊。他已经晕了， 腿软了。

这脚又特别 嘿，大家好，我们推出的第一个系列课程， pcr 训练营基础班课程已经开课。 皮西亚训练营基础班课程分为实践篇、运行篇和管理篇三个主题，共六讲课程， 课程安排隔千上线一讲内容，敬请关注。那我们在之前的第一讲课程主要是通过学习 pcr 技术原理来掌握我们在实际检测工作中的实验原理。今天我们开始第二讲内容 剖析实时荧光披瞎扩增原理，学会学会数据曲线分析。 那实时荧光定量 pci 阿姨是在普通 pc 阿姨的基础上加装了 呃，荧光激发装置和荧光检测装置，皮虾扩增和检测是同时进行的，最终结果，不需要再进行电影检测，所以他可以有效的避免了样品间的交叉污染。 实时荧光 pcr 扩增呢，分为四个主要阶段，分别是机线期、指数增长、嗯，指数增长期、线性增长期和平台期。 机械期为扩增最初的十到十五个循环，此时 pcr 反应处于起始阶段，扩增产物很少，所产生的荧光信号也很低，因此机械荧光信号可根据此阶段产生的荧光信号来计算。指数增长期进入指数增长期 初期，荧光强度会达到一个预值，该预值通常为机械荧光信号均值标准差的十倍。扩增达到预值时的循环数可成为 ct 值。 那线性增长期是 pcr 达到期最大的扩增阶段。理想条件下，在线性增长期每一个循环后， pcr 产物是被比增加的 平台期。就是说在 pcr 扩增达到平台期呢？嗯，的时候呢，他的荧光信号是不会再随着扩增循环数的增加而增加。 实时荧光定量 pcr 技术有四个关键的要素，也是我们需要掌握的四个概念，四个概念分别是 s 型扩增曲线、机线预值和 ct 值。那接下来我们逐个解析。首先看第一个关键要素， s 形扩增曲线。呃，其实 s 型扩增曲线我们觉得很好理解，就是看着像 s 形状不就对了吗？其实呢，这只是表象。那可以说 s 型扩增曲线至少要具备两个特征。第一个特征，曲线要形似这个字母 s 状 啊。嗯，然后你看，我们通过这个线性图谱和对数图，呃，那个我，呃，我们通过线性图谱和对数图谱，嗯，呃，这形式来看，因为我们知道心性图谱和对数图和对数图谱呢，是扩增曲线图谱的两种展示形式。而这个多组分的这个图谱， 他是保留了扩增曲线的原始形态，扣掉机线之后，那扣掉机线之后，他就会形成前面的这种线性图谱和这种对数图谱的形态。第二个特 特征呢，是曲线上要可以观察到有机线期、指数增长期、线性增长期和平台期。 那我们可以看右边的这个图啊。呃，嗯，并且这个第二点特征呢，也是最关键的要点。那在极限期 pcr 因为刚刚开始反应，所以受到的背景信号的，呃，是那个， 所以说他受到背景荧光信号的影响是没有什么明显变化的，就像一条直线啊，我们可以看这个右边图片，这个蓝色标记的这个线， 那随着循环数不断增加， pcr 反应积累的荧光信号就会超过了背景信号，然后就会进入指数增长期，那这个时候 dng 和美的活性还是很高的， dntp 也很充足，引物探针也是非常充足的，所以说 pcr 产物增 增加接近理论的两倍，荧光信号增加也同样是约两倍左右，那因此指数增长期是符合 pcr 理论方程的。那我们在这个线性图谱中， 曲线呢？呃，向上迅速抬起，在对数图谱中，曲线斜向上增长。四，呃 就像一条直线。然后我们在这个图中，呃，可以看这个浅红色标记的这一段曲线，那随着循环数继续增加，就会进入这个线性增长期， 那呃，也随着 dng 和酶活性的下降， dntp 和引物探针也不再充足，那这时候 pcr 扩增产物的增加就不再是两倍了，而是要小于两倍，并且它这个倍数也是在不断降低的。嗯，我们可以看这个图中浅灰色标记的这 段曲线，那最后随着循环数的增加，荧光信号几乎是没有变化，就进入了平台期，也就是我们图片中这个呃浅棕黄色标记的。 那我们再看第二个关键要素，机线。什么是机线？机线就是扩增曲线中的水平部分皮下最初的一些循环，在此阶段扩增产物很少，并且循环之间的荧光信号几乎没有变化，荧光信号积累，但是低于仪器的检测 就是，但是他会低于仪器检测。呃，线之下的这些 pcr 循环，那机器软件就是，呃，一般的机器软件通常会将他的机线设定为三到十五个循环嗯，之间的这个荧光信号，但是呢，很多情况下也是需要进行人工设置的，比如说啊，像我们在 片中所展示的，那我们可以看到这是一条青岛了的 s 型扩增曲线，那通过分析曲线，我们可以看出他的机线是应该设在二十个循环左右，所以，呃，这个呢，就是因为自动机线设置问题出现的这种异常的曲线。 他的解决方法也是很简单啊，就是说，嗯，我们通过一些手动的来设置机线，将机线的这个末循环数设为二十，那设置完成之后，他这个青岛的这个 s 型呃扩增曲线就会回归到正常的爱情曲线了。 嗯，第三个关键要素预值，他其呃预值实际是样本的荧光背景值和音性对照的荧光值。那预值线的设定方式也是有两种，一种是 软件自动确认的，另外一种就是手动设置，那自动设置呢，一般是三到十五个循环的荧光信号的标准偏差的十倍，那手动设置时是要，嗯，就是设置到大于荧光背景值和音性对照的荧光最高值， 选择在进入指数期的最初阶段，尽可能的要低一点，那样本的真正检测信号是荧光信号超过预值之后的这个荧光信号，呃，其实在日常实验过程中，呃预止线需要手动设置的情况还是比较常见的，比如说我们下面这这两张图， 那左边这个 a 图，呃，当预知线没有按照要求设定的时候，我们发现阴阳性结果的区分是不清晰的。那右边这个 b 图呢，是我们经过呃手工 设置啊，那个把预支线，嗯进行一个正确的设定，嗯，然后把它设定在这个指数期的初期，那我们可以发现他的阴阳性结果判定就会比较清晰。但是呢，在这里我们也要特别注意的是，如果说是阴性指控品的扩增曲线出现上升， 那实验室就应该景气，并且要排除污染的可能，而不是强行将玉质线设定高于阴性指控品的这个曲线啊，这个我们一定要注意。 那第四个关键要素，嗯，就是 ct 值，它是指 pcr 扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的预值时所经过的扩增循环次数。 ct 值与模板其实浓度是密切相关的，模板电量越多，荧光达到预指的循环数就会越少，也就是说 ct 值就会 越小。那关于 ct 值与样板量的关系，嗯，其实是与这个扩增效率密切相关的，那我们可以通过相关的公式来看，如果说我们设定我们的 pcr 扩增效率为百分之百，那么核酸初始量每相差十倍， 那标本检测的 ct 值就应该相差三点三二个 ct， 那如果说我们的呃标本 ct 值分别差了 ct 值差一、差二、差三，那它其实的浓度对应的应该是相差了两倍、四倍和八倍 啊，他是呈现这么一个规律，那如果说，嗯， pcr 扩增效率达不到百分之百，因为我们也知道在日常检测过程中，很难理想值是百分之百，我们尽可能的让扩增效率达去接近百分之百，但是很有可能会达不到， 那如果说他的过增效率只有百分之五十的话的情况，我们在通过这个公式计算可以发现，核酸初始量每相差十倍，标本检测的 ct 值就会相差五点六八， 然后如果说我们实验室进行一个验证啊，采用这个十倍的七度西式标本再进行核酸检测，那我们会发现 c 期值 大于三点三二，就说明他的扩动效率较低。就是说我们说如果百，如果他的扩动效率是百分之百，那十倍的一个稀释，他的 ct 值应该相差三点三二。 如果说他的 ct 值就是十倍，稀释之后 ct 值大于三点三二，就说明他的扩增效率低，就达不到百分之百，就是 ct 值相差越大，就说明反应体系 pcr 扩增的效率 越低。这个我们可以在日常实验中可以做相关的一个验证哈，就是可以拿我们那个呃指控品自己来稀释来验证一下我们现行的这个呃整个的检测系统，它的一个扩增效率如何。 嗯，我们也只有掌握，就是手链，掌握实时荧光定量 pcr 技术的原理以及关键的要素。所以说然后我们才能更好的来分析和辨别 pcr 库存中的各类曲线。当然我们在进行核酸检测实验中也会遇到各类问题， 大多也都是通过一些异常的曲线来表现出来的。那接下来我们主要是来呃分析一些工作中常见的一些异常曲线案例，以及这些曲线产生的原因和处理方法。嗯，那第一个常见问题就是这个 pcr 出现扩增意志的现象 啊，我们看到这个片子就是左边片子里呃这个曲线啊，出现的两条扩增曲线，那经过分析扩增曲线荧光强度的大小以及 ct 值的大小，可以提示这个呃 h 七孔的曲线是存在扩增意志的， 那其实这类方法也很好解决，就是说我们可以将样本进行稀释之后再扩增。呃，为什么说稀释通过稀释之后再扩增来验证呢？是因为如果说他存在抑制物的话，呃，这个标本中有抑制物的影响，我们通过稀释的方法是可以消除的。 那提到扩增意志，我们也来复习一下临床标本中 pcr 抑制物的来源以及作用机制。呃，在临床标本中的 pcr 抑制物主要有两个来源，内源性和外源性。内源性及千人存在于标本中的，呃， 呃，一些组就是标本的组成成分，比如说啊，像血液标本，一些免疫球蛋白蛋白酶，血红蛋白啊，还有一些代谢产物什么之类啊，尿素、离子多糖等。那外源性的主要 像，嗯，这个，嗯，像一些甘肃抗凝剂啊，纤维素，呃，还有硝酸纤维素，以及说我们那个过度紫外线肇事之后产生的这个矿物窑啊，手套的滑石粉， 嗯，甚至我们说我们这个采用管的不洁净啊，他都会含有一些抑制物。那 pcr 抑制物中的大部分的作用机制目前还不是完全清楚，但基本上是可以分为三类的， 第一类是干扰核酸吸取过程中的细胞裂结，第二类呢，是降解和包裹核酸啊。第三类就是，嗯，使这个热稳定的低烟聚合酶失火 啊。这个就是属于一个知识的补充。其实我们在学习这个，呃，实时荧光 pci 技术这本书的时候呢，上面也有明确的一些说明，所以大家在日常看书的时候也可以注意这些细节， 嗯，那第二个常见的问题就是这种自动设置机线有问题导致的异常曲线。其实机线的问题呢，也是我们嗯经常会遇到的，以以前我们可能会认为机线基本上仪器自动设定就可以了，但是，呃，近期来呢，嗯，发现出现这种因为机线是 机线自动设置嗯导致的异常曲线的情况越来越多。像我们前面说到那个青岛型的，就是青岛的 s 型曲线，它就是一个减型的这种因为机线设置原因导致的异呃异常曲线。那其实还有一类就是说像我们图片中所展 是的这种啊，因为机线自动扣除错误导致扩增曲线抬升。那我们通过这个图可以看到这个多组分图扩增曲线是没有抬升的，就上面这个图是没有抬升的，但是，呃，那个，呃，就是我们通过这个上面这个图呢，这个通过这个多组分这个图我们可以看出它是明显的一个阴性样本， 嗯，但是呢，就是下面这个扩增曲线，扩增的曲线就出现了抬升，并且呢与这个预直线有个交汇，呃，反而有了 ct 值。那出现其实这个原因呢，都是说我们的软件在进行机械做呃自动扣除的时候出现了错误，嗯，从而引起的这种扩增曲线的抬升。那， 那像引起这样的原因，嗯，可能会包括哪些呢？啊？主要是包括像我们选用这些耗材试剂或者操作的原因导致的这 背景荧光信号有所波动，从而造成了这个反应孔的自动机线扣除的错误。解决的方法很简单，那出现这种情况，我们就可以采取手动调整机芯的方法来重新定义机线啊，机可以恢复正常啊。就是说将机线起点改为荧光信号稳定的循环一般是三， 循环数一般是三，那机线终点是要改成扩增曲线起风前的一个循环数，比如说如果说他的起风是在第二十五个循环，那我们机线设定点是在二十四。 嗯，第三个常见的问题就是因为使用耗材，使用的耗材有问题，导致出现的一些异常曲线。我们这个图片中所展示的是由于耗材使用不当引起的扩踪曲线异常，那原因就是使用了。

很多同学都有个疑问， pcr 技术不是用来复制电分子的吗？那怎么用 pcr 技术去获取木质金呢？我们通过 pcr 技术扩增木质金这个过程来帮助大家去理解。 首先我们这里面有一段这个癫疯子，那么这个癫疯子我们把中间蓝色的部分啊，表示某个新片段，那么大家可能很容易去理解啊，我们把整个癫疯子给复制下来， 这个其实就是模仿体内淀粉的复制，但是我们现在呢，用皮斯亚技术只去获得中间这个蓝色的去对应的目的精，那怎么去实现呢？那么这就是目的精的这个获取，他最重要的一个条件就是我们 人为控制合成的影物，当然影物一般是成都型的，对吧？这一对影物我们事先合成的时候呢，就按照这个木质星两端来合成 啊，不是按照整个巅峰子的两个末端，如果按照巅峰子末端的话，就把整个巅峰子都复制下来了，我们现在这两个引物就是跟木质青的脸蛋结合， 那么这样呢，这个巅峰的复制的时候啊，顺着引悟这个目击呢，这个巅峰子开始向里面延伸，那么这样的话就会形成这样两个巅峰，这是第一次复制，那么第二次再复制 啊，双链解开，那么这个引窝再上去结合，再上去结合的话呢，进行第二次复制，那么这个时候我们可以看到是不是就开始出现了就 第二次复制的结果，你们开始出现有一个单念跟目的经正好是一样长的，序列是一样的，但是依然还有很多的片段，它含有非目的经的序列在里面，所以呢第二次复制我们仍然无法获得啊，这个目的金流片段， 但是我们再进行第三次复制就可以了，大家看第三次复制，当烟雾结合上去，并且开始延伸复制的时候啊，那么大家可以看一下，是不是就有一部分的这个电分子复制出来的结果就含有木筋。大家可以看到啊，我们在 第三次复制的时候呢，产生了八个电分子，那么这八个电分子里面有两个就跟我们的目的是完全一样了，当然有同学讲，这八个电分子里面有两个 哥们的敬仰，还有很多的需巅峰子训练，里面有很多非目的性的训练，那么这个是不是太少了，而且混在一起。 那么实际呢，我们通过大量的这样的一个皮下或者复制增值，你会发现复制一段时间以后， 他这个皮斯亚库存出来的这个电分子当中，和目的基因一样的序列占的是绝大多数，比中是非常非常高的，那么还有一些非目的基因序列的，这个他想的比较少 哎，所以当数量多到一定程度时候，我们基本上就可以分目的地，这种片段呢就可以忽略不计啊，就复制次数越多，含木质金的，这个跟木质金完全一样的，这个训练的就会越多， 这就是披萨裤子穆丁的具体的过程。

传统手工修整滚环高度依赖操作者的经验与手感，修整量难以精确控制，槽形一致性无法保证，且不同操作者之间差异显著，这种不确定性直接影响杂志工艺的稳定性。滚环修整即以数控系统为核心，将修整参数数字化、标准化， 修整深度净给速度走到次数均可精确设定并重复执行。无论谁操作，修整结果始终如一。经验不再是个人的专利，而是固化在设备中的标准工艺，用系统的稳定取代人为的波动。