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🌟CRISPR-Cas9系统:sgRNA设计及质粒构建!【DLab实验中心】分享超全的sgRNA设计及质粒构建步骤,轻松搞定基因编辑,快来看!👀 📘CRISPR-Cas9系统简介 CRISPR-Cas9系统通过sgRNA引导Cas9蛋白结合目标DNA,引发双链断裂,细胞修复机制实现基因组精准编辑,为疾病治疗和基因研究提供创新工具。 🌈sgRNA设计原则 ✔️特异性 确保sgRNA特异性,避免基因组中多个匹配位点,减少非特异性编辑。 ✔️GC含量均衡 sgRNA的GC含量应控制在40-60%,确保稳定性和杂交性。 ✔️避免多个剪切位点 选择只有一个目标剪切位点的sgRNA,避免非预期多基因编辑。 ✔️避免重复序列 避免选择基因组中重复序列或高度相似序列区域,减少非特异性剪切。 ✔️避免RNA结构影响 确保sgRNA序列无稳定二级结构,提高实验有效性。 ✔️移码突变 引发移码突变时,sgRNA应设计在CDS区域,靠近蛋白N端,理想位置是第一或第二外显子。 ✔️同源区域 基因有多个转录本时,sgRNA设计在同源区域,确保对所有转录本有效。 🧬sgRNA设计步骤 1️⃣获取基因信息 在NCBI主页Gene界面输入基因名称,获取基因信息,选择编辑区域。 2️⃣查找同源区 点击GenBank,下载序列,用SnapGene查看同源区具体碱基序列。 3️⃣查找共外显子 在转录本序列中查找共外显子,标记其在转录本上的位置。 4️⃣设计sgRNA 将共外显子序列复制到sgRNA设计网站,输入同源区域碱基序列,选择物种和Cas9蛋白,获取sgRNA序列信息。 5️⃣引物合成 将设计好的引物送引物公司合成。 🌈质粒构建方法 1️⃣酶切载体 使用BsmBI酶切LentiCRISPR-V2质粒,胶切回收备用。 2️⃣引物退火 配置退火体系,37℃30分钟,95℃5分钟,降温至25℃。 3️⃣连接 配置连接体系,室温放置20-30分钟。 4️⃣质粒转化 #干货分享 #科研日常#研究生#实验室#实验室日常
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