做了无数次免疫荧光,成功率一直很高😇。之前发过文字版本的protocol,以及很多小tips,这次分享一下视频从头到尾的操作叭~ 免疫荧光可以用目的一抗染内源蛋白,也可以转染核酸进入细胞染外源蛋白,根据自己的需求选择用什么方法~ 例如标记线粒体,就需要染内源TOM20或者VDAC等… 如果内源蛋白表达很低很低,则可以外转进去然后标记 免疫荧光比western信号会低很多,一抗二抗使用浓度也会更高(1:200~1:500) 如果做外转标记蛋白,必须要保证转染效率! 提高转染效率的方法: 1、采用适宜的密度:70% 2、转染试剂的选择:lipo2000或lipo3000 3、若是难转染的贴壁细胞,或者悬浮细胞,神经细胞等…建议做稳株后再做免疫荧光,效果会好很多 4、转染前预处理: 采用转染前专用培养基预处理,主包一直在用的是XR西瑞家的,很好用❗️@XR西瑞无限 细胞40%密度时,把培养基弃掉,换成XR转染前专用培养基,培养12~24h,我一般就是培养过夜,这时密度大概70%,刚好做转染。 这个培养基可以增强细胞对核酸的摄入,提高转染效率,做免疫荧光很适合使用了~日常做转染也可以用 细胞状态不会受影响 做免疫荧光不建议采用三无培养基饥饿处理,虽然这种方法也会一定程度上提高转染效率,但是会影响细胞状态,状态差的细胞做出来的结果很可能不尽人意 ps:贴壁细胞转染后24小时,消化细胞重铺于爬片上,消化时一定要注意不要消化过度!此时细胞携带核酸,比WT细胞脆弱一些,XR的消化酶很温和,基本不影响细胞,而且消化很快,大概1min就能消化下来,推荐! #实验室日常 #科研 #科研狗的日常 #研究生 #读博的日子
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