亲和层析是利用分子间特异性互相作用而进行分离的一种层析技术,生物分子间存在很多特异性的相互作用。组氨酸标签蛋白对 Ni2+及其它一些金属离子有高选择性的亲合力,这些金属离子能够用螯合配体固定在层析介质上。因此带有组氨酸标签的蛋白能够选择性结合在装配了金属离子的填料上,而其它的细胞蛋白则不能结合或仅能微弱结合。以下是组氨酸标签蛋白常用的几种填料: Ni-IDA Ni-IDA 填料是以亚氨基二乙酸(IDA)为配基,螯合镍离子(Ni²⁺)后制成的金属螯合亲和层析填料。它通常以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质,IDA 通过化学方法偶联到琼脂糖凝胶上。IDA是三配位,与Ni²⁺螯合后形成比较稳定的平面四边形结构,有更多位点与组氨酸标签上的咪唑环配位,从而结合目的蛋白。其特点是蛋白载量较高。 2、 Ni—NTA Ni-NTA 填料是将氮川三乙酸(NTA)作为配基,螯合Ni²⁺后得到的。NTA是四配位,与 Ni²⁺形成非常稳定的八面体结构,镍离子处于八面体中心,能有效保护镍离子免受小分子进攻,结构更加稳定。Ni-NTA 填料对螯合剂、还原剂、碱性等具有更好的耐受性,适用性更广,配体更稳定,选择性也更高。 3、 Ni-TED Ni-TED填料是以三乙基四胺二乙酸(TED)为配基螯合Ni²⁺的填料。TED与金属离子形成五配位结构,是三者中最为稳定的。这种高度稳定的结构使得Ni-TED在极端条件下依然能保持其结合能力,对螯合剂EDTA和还原剂(如DTT)具有极高的耐受性。Ni-TED的特点是特异性和纯度极高,尤其适用于对纯度要求极高的实验,但其结合蛋白量相对较低。 4、 未螯合金属离子的介质 IMAC填料的分离逻辑基于 “配体-金属离子-目标蛋白” 的三级相互作用。在琼脂糖、磁珠、硅胶等基质表面,通过化学键连接螯合配体(如 IDA、NTA、TED),配体通过氮、氧等原子与金属离子(如 Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺)形成稳定螯合物,使金属离子固定在填料表面。 #His标签 #蛋白纯化 #亲和层析 #Ni-IDA #Ni—NTA
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提香7月前
1、P1中葡萄糖增加渗透压,促进细胞壁和细胞膜裂解,还有增大粘度,减少机械剪切力,防止DNA 断裂并保证菌体不至于快速沉降而悬浮的作用;EDTA是螯合剂,与金属离子结合,尤其是钙镁离子,而它们俩也是细胞膜的重要成分,对胞内酶的活性很重要,且细胞壁最外层是LPS,带负电荷,其稳定性与足够多的钙离子相关,所以EDTA螯合掉Ca2+会使LPS解体,暴露出内层的肽聚糖,同时破坏细胞膜,抑制胞内酶活性,如核酸酶,降低DNase对DNA的降解。 2、P2中NaOH与SDS可裂解细胞壁,释放细胞内容物,并使DNA、蛋白变性并形成交联网状结构而沉淀,在这个过程中,chromosomal DNA会被降解成线性片段,强碱条件下发生变性分离变成单链,但plasmid DNA相对耐受,仍以双链形式存在。最后下一步的沉淀可以通过离心去除。所以碱性需要适度,不能太强了,即这步也不能时间太长,没必要静置,也不要剧烈震荡,可能导致断裂的基因组DNA碎片很可能会和质粒混在一起; 3、P3中醋酸钾缓冲液主要是中和NaOH,且醋酸钾与SDS作用,反应生成十二烷基硫酸钾并带动蛋白质沉淀,高浓度的盐溶液加上高速离心可以让SDS-protein-chromosomal DNA复合物以及细胞裂解物等沉淀析出,而plasmid DNA溶解在上清中,因为闭环质粒可以复性,但DNA不能复性; 4、wash buffer主要是清洗掉多余的盐离子,因为plasmid DNA会吸附在柱子或者磁珠上,然后用70%乙醇把盐洗掉,再用水把plasmid DNA从柱子上洗脱下来就可以了,所以可以用移液枪环绕吸附柱冲洗,而有时候洗液里的乙醇会影响后续的酶切或测序反应,所以要空柱离心和彻底蒸发乙醇; 5、配方不同,用的柱子也不同,大概要看一下使用的试剂盒。有的试剂盒就没有葡萄糖,有的就挪动了胍盐,有的有盐酸胍,有的Tris base和Tris HCl混合调整缓冲,或者调整了EDTA二钠,有的是醋酸钠而不是醋酸钾,很多情况都有可能,而看并记熟流程,再一气呵成快速操作是肯定没错的。
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未来能源存储神器!为啥2025诺贝尔化学奖要发给MOF? 金属有机框架(Metal-organic frameworks, MOFs)是一种新兴的高孔材料,由金属团簇或金属离子和有机配体组成,在过去的30年里得到了广泛的研究。由于其独特的结构特点,包括永久孔隙率、高比表面积、可调节的孔径尺寸和形状等,MOFs在气体储存、分离、催化等领域受到了特别的关注。 瑞典皇家科学院8日宣布,将2025年诺贝尔化学奖授予日本科学家Susumu Kitagawa、澳大利亚科学家Richard Robson和美国科学家Omar M. Yaghi,以表彰他们“开发了金属有机框架”。 Yaghi及其同事在1995年提出了MOFs的概念。随后在1999年,他们以硝酸锌和对苯二甲酸为原料合成了孔隙率大、比表面积高、热稳定性好的MOF-5。MOF-5是一种典型的MOFs材料,其合成和表征方法在MOFs研究领域具有里程碑意义。在随后的20年里,Robson, Yaghi和Kitagawa等研究人员设计和合成了大量结构新颖、性能优良的MOFs。 有机配体是MOFs的重要组成部分,是调控MOFs结构和性能的关键因素。用结构相似但取代基不同的有机配体合成的MOFs的结构和性质也不同。探索由于采用不同取代基配体导致的MOFs的结构和性能差异,有助于实现MOFs材料的定向合成。羧酸配体具有多种配位方式,容易与金属离子或者金属团簇形成稳定的配位键。刚性羧酸配体倾向于形成稳定的孔洞结构,而柔性羧酸配体则倾向于形成新颖的骨架结构。半柔性羧酸配体结合了前面两类配体的优点,可以在保持MOFs孔洞结构稳定的同时,通过改变自身构型实现MOFs材料结构的多样化和功能化。#诺贝尔化学奖 #MOF #材料 #毕得医药 #毕得试剂
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