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亲和层析是利用分子间特异性互相作用而进行分离的一种层析技术,生物分子间存在很多特异性的相互作用。组氨酸标签蛋白对 Ni2+及其它一些金属离子有高选择性的亲合力,这些金属离子能够用螯合配体固定在层析介质上。因此带有组氨酸标签的蛋白能够选择性结合在装配了金属离子的填料上,而其它的细胞蛋白则不能结合或仅能微弱结合。以下是组氨酸标签蛋白常用的几种填料: Ni-IDA Ni-IDA 填料是以亚氨基二乙酸(IDA)为配基,螯合镍离子(Ni²⁺)后制成的金属螯合亲和层析填料。它通常以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质,IDA 通过化学方法偶联到琼脂糖凝胶上。IDA是三配位,与Ni²⁺螯合后形成比较稳定的平面四边形结构,有更多位点与组氨酸标签上的咪唑环配位,从而结合目的蛋白。其特点是蛋白载量较高。 2、 Ni—NTA Ni-NTA 填料是将氮川三乙酸(NTA)作为配基,螯合Ni²⁺后得到的。NTA是四配位,与 Ni²⁺形成非常稳定的八面体结构,镍离子处于八面体中心,能有效保护镍离子免受小分子进攻,结构更加稳定。Ni-NTA 填料对螯合剂、还原剂、碱性等具有更好的耐受性,适用性更广,配体更稳定,选择性也更高。 3、 Ni-TED Ni-TED填料是以三乙基四胺二乙酸(TED)为配基螯合Ni²⁺的填料。TED与金属离子形成五配位结构,是三者中最为稳定的。这种高度稳定的结构使得Ni-TED在极端条件下依然能保持其结合能力,对螯合剂EDTA和还原剂(如DTT)具有极高的耐受性。Ni-TED的特点是特异性和纯度极高,尤其适用于对纯度要求极高的实验,但其结合蛋白量相对较低。 4、 未螯合金属离子的介质 IMAC填料的分离逻辑基于 “配体-金属离子-目标蛋白” 的三级相互作用。在琼脂糖、磁珠、硅胶等基质表面,通过化学键连接螯合配体(如 IDA、NTA、TED),配体通过氮、氧等原子与金属离子(如 Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺)形成稳定螯合物,使金属离子固定在填料表面。 #His标签 #蛋白纯化 #亲和层析 #Ni-IDA #Ni—NTA
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