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离子交换色谱的详细实验步骤实验原理离子交换色谱基于目标分子(如蛋白质、核酸)与固定相(离子交换树脂)之间的电荷相互作用进行分离。阳离子交换色谱(CEX):固定相带负电(如磺酸基团),结合带正电的分子。阴离子交换色谱(AEX):固定相带正电(如季铵基团),结合带负电的分子。 通过调节缓冲液离子强度(盐浓度)或 pH 改变目标分子与树脂的结合能力,实现选择性洗脱。实验材料与试剂色谱柱预装柱(如 HiTrap SP Sepharose FF 阳离子柱,HiTrap Q Sepharose FF 阴离子柱)。空柱(可自填树脂,如 DEAE-Cellulose、CM-Sepharose)。缓冲液平衡缓冲液(低盐):20 mM Tris-HCl(pH 8.0,AEX)或 20 mM NaAc(pH 5.0,CEX)。洗脱缓冲液(高盐):平衡缓冲液 + 1 M NaCl(梯度洗脱)或特定盐浓度(阶段洗脱)。再生缓冲液:2 M NaCl。保存缓冲液:20%乙醇 + 0.1 M NaOH(长期保存)。仪器液相色谱系统(如 ÄKTA pure)或手动层析系统。UV检测器(监测 280 nm 吸光度)。馏分收集器、电导仪、pH计。 实验步骤一、柱子预处理与平衡柱子安装将色谱柱连接至系统,确保无气泡(轻拍柱体或反向冲洗)。用纯水冲洗 2 倍柱体积(CV),流速 1 mL/min。平衡柱子用 5–10 CV 平衡缓冲液冲洗,直至电导和 pH 稳定(电导值接近平衡缓冲液)。二、样品制备样品处理离心或过滤(0.22 μm 滤膜)去除颗粒物,避免堵塞柱子。透析或超滤置换样品缓冲液,使其与平衡缓冲液一致(离子强度 ≤50 mM)。上样体积柱载量参考树脂说明书(如 1 mL HiTrap 柱载量 10–20 mg 蛋白)。上样体积 ≤30% 柱体积(避免过载)。三、上样与结合上样操作流速:1–5 mL/min(根据柱子尺寸调整)。监测 UV 280 nm 基线,记录穿透峰(未结合蛋白)。冲洗未结合物用 5–10 CV 平衡缓冲液冲洗,直至 UV 信号回到基线。四、洗脱目标分子方法一:梯度洗脱(高分辨率)线性梯度设置洗脱程序:0–100% 洗脱缓冲液(含 1 M NaCl)梯度,5–10 CV。#生物实验室 #实验室出租 #生命科学 #生物实验 #细胞
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