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wb磷酸化蛋白怎么跑 科研日记🌸手把手教你wb磷酸化蛋白怎么跑?Western Blot 是检测磷酸化蛋白质的重要实验方法, 其实和跑正常蛋白没什么出入,然而磷酸化蛋白可能仅占细 胞总蛋白中的一小部分,处理不得当还会快速去磷酸化。 [彩虹R]一、合适的诱导方式✅ 磷酸化蛋白在样本中含量较低,参考已有研究对样本进行诱导,使目标蛋白磷酸化高水平表达。 [彩虹R]二、样品处理与保存🏺 1️⃣快、狠、准。 蛋白磷酸化是一个快反应,制样过程要迅速,样品要新鲜,全程冰上操作。所有用到的试剂,器具要提前预冷。 制备的样本需要尽快变性并放在-80°保存,避免反复冻融导致磷酸基团降解。 2️⃣裂解液中一定要加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂,否则条带出来会很浅。细胞裂解会释放大量内源性蛋白磷酸酶,会催化磷酸化蛋白去磷酸化。 [彩虹R]三、确保足够的上样量 磷酸化蛋白表达丰度低,大概只有总蛋白10%甚至更低,所以每孔需要足够蛋白量。 [彩虹R]四、合格的抗体 1️⃣选择好的磷酸化抗体是成功的关键因素,这是实验成功的保证。 2️⃣抗体的稀释倍数也要适当,可依据实验结果优化调整。 孵育磷酸化抗体即一抗后建议4度过夜,保证抗体有充分的结合时间【因为通常磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分】 💡明星产品推荐: abmart抗体🐮 ▪️磷酸化抗体——做信号通路必入! ▪️重组抗体——无血清生产,批次更稳定 ▪️定制服务——🐭/🧬特殊物种/表位,专属方案 ⚠️小白避坑Tips: “一抗总翻车?试试Abmart的免费小样!” “同靶点对比3家数据,他家文献引用率超高📊” [彩虹R]六、总蛋白的检测 需要检测 磷酸化蛋白、对应靶标的总蛋白、内参蛋白 ⚠️检测总蛋白可以验证目标蛋白在样本中是否存在; ‼️计算=磷酸化蛋白/总蛋白 比值可作为蛋白质磷酸化程度的指标 #科研学习#细胞实验 #实验室日常#abmart#wb实验
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