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液相串联质谱(LC-MS/MS)测植物激素前处理 植物体内含有的激素是微量的,使用LC-MS/MS测定其中的含量,精准度更高一些。前处理过程,主要通过研磨、溶解、离心、提纯等步骤完成。 1.如果植物样本太大,难以溶解在有机溶剂中。需要将新鲜的植物样本(如叶片、根茎)洗干净后切碎,并通过液氮来研磨成很细的粉末,低温(-196℃)能有效抑制细胞内各种酶的活性,防止叶片中的生物成分在研磨中被降解,同时将植物成分更彻底的释放出来。研磨前将研钵、杵等工具预冷,保持液氮能覆盖到样本,操作过程要佩戴防冻手套,避免飞溅。称量到棕色离心管中,避免长时间光照。 2.先将样本溶入到缓冲盐中,里面要加入80%甲醇或异丙醇(加入1%的甲酸,避免脱落酸、赤霉素等在提取过程中分解),在冰浴条件下充分混合。4℃振摇30min或4℃超声提取1h,充分破碎植物细胞,将植物激素从细胞中提取到溶剂中。 3.根据文献资料或经验,浸提液用10000r/min的转速离心10min,足够的相对离心力可让密度较大的固体颗粒(如细胞碎片、蛋白质沉淀)快速沉淀到离心管底部,植物激素会保留在上清液中,实现固液分离。离心的参数是基于实验结果获得的,根据需求可进行调整优化。 4.加入二氯甲烷(CH2Cl2)萃取,二氯甲烷属于中等极性有机溶剂,和许多植物激素的化学结构相匹配,可有效的溶解植物激素,它的溶解能力要高于水或甲醇等,它的密度大于水,当植物激素被溶解进二氯甲烷中,会自然的沉降在水相的下方,清晰的两相分层可提高植物激素的纯度。通过相同的分离步骤(4℃条件下,超声30min,10000r/min离心10min)得到有机相。这个实验步骤,可根据具体植物激素的种类,添加或省略。 5.净化和浓缩,用氮吹的方法吹干有机相。通入氮气进行吹扫,目的是将二氯甲烷等有机溶剂挥发掉,剩下水相。再用含有0.1%甲酸的甲醇或乙腈重新溶解,稀释为2倍。这个时候获得的样本溶液,已经是比较纯净的植物激素了。一般都是用流动相来溶解,避免引起溶剂效应。比如,用甲醇或乙腈和水(0.1%甲酸)为流动相。 6.过滤,是用0.22um的滤膜,去除颗粒物。0.22um的膜可通过物理屏障的作用截留微生物,植物激素等小分子物质可顺利通过滤膜,常用尼龙等滤膜材料,化学性质稳定。以上的操作,需要在低温环境下操作,避免激素的降解。#科研检测 #液相质谱 #植物激素 #LCMSMS
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