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📚免疫共沉淀Co-IP实验步骤➕结果解读!免疫共沉淀(Co-IP)是研究蛋白质相互作用的常用方法,今天就来给大家分享Co-IP实验的详细步骤和结果解读,快拿起小本本记下来吧!📘 🌈实验原理 ✔️抗原-抗体特异性结合:抗体特异性识别并结合目标蛋白质。 ✔️蛋白质复合物形成:目标蛋白质与其他蛋白质形成复合物,抗体结合后整个复合物被沉淀。 ✔️沉淀与洗涤:使用Protein A或Protein G等固相载体沉淀抗体及复合物,洗涤去除非特异性结合的蛋白质。 ✔️分析相互作用蛋白:通过SDS-PAGE分离,考马斯亮蓝染色或Western blotting鉴定相互作用蛋白。 🌈实验步骤 1️⃣细胞培养与裂解: 培养细胞至合适密度,选择6孔板或T25/T75培养瓶。 过表达兴趣基因,裂解细胞,收集上清,切记不可超声。 2️⃣抗体孵育: 使用诱饵蛋白的IP级抗体,4℃摇床孵育过夜。 留取蛋白裂解液进行WB,称作Input。 3️⃣免疫共沉淀: 加入Protein A/G磁珠,4℃摇床孵育过夜。 预处理磁珠,使用BSA减少非特异性结合。 4️⃣免疫沉淀物富集: 利用磁力架富集磁珠,强酸洗脱,煮沸后SDS-PAGE/WB检测。 🌟常用术语 ✔️Input:全蛋白溶液,用于检测诱饵蛋白与靶蛋白表达。 ✔️IgG:抗体对照,证明抗体特异性。 ✔️IP:免疫沉淀使用的抗体。 ✔️IB:免疫印迹WB实验结果。 🌈结果解读 🔎样品类型:使用人和大鼠样品。 🔎细胞处理:处理四组细胞样品。 🔎抗体选择:使用P65抗体,检测与P65相互作用的CDK9。 🔎Input验证:证明全蛋白溶液中存在P65、CDK9,β-actin作内参。 💡【DLab实验中心】注意事项 ⭕️抗体选择:确保抗体适用于Co-IP。 ⭕️磁珠处理:磁珠容易聚团,需使用旋转仪辅助。 ⭕️洗脱条件:强酸洗脱时注意pH值和时间。 ⭕️抗体重链轻链:若目的条带与重链或轻链位置重叠,需使用不含重链或轻链的HRP二抗。 #科研日常#实验#研究生#科研实验#实验人
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