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qpcr实验步骤视频版🔥 qPCR实验通过ΔΔCT法计算出flod change从而得到RNA在不同处理下的表达情况。那么实验过程是怎么样的呢?今天我们跟着视频一起来看一下吧~ ✅实验准备 提前准备好cDNA(模板)、引物、SYBR mix、ddH20、耗材等 Tip:在冰箱里长期放置的试剂会挥发或析出沉淀导致液体不均匀,所以试剂都需要先涡旋混均后离心才可以打开使用~在使用时候要记得轴对称配平和拧上保护盖哦~ ✅试剂配制 一般情况下配制20uL体系进行qPCR实验,为了节省试剂和样品,也可以配制成10uL体系哦~因为需要配制复孔(技术学重复)以减小误差,所以可以先将除了cDNA以外的试剂配完,分装到PCR板上,再逐一添加cDNA 试剂 体积 2x SYBR mix 5ul 引物F/引物R 0.25ul/0.25ul ddH20 2.5ul cDNA 单独加入2ul ✅PCR布板 每一行连续的三个孔(如A1、A2、A3)作为技术学重复,加入一模一样的体系和cDNA。可以在板子上先每三个画一条竖线区分。 给大家分享一个小技巧,做qpcr实验结果想要稳定就需要加样准确无误差的移液器,比如我们实验室就会单独放在一个实验台只进行定量实验,加样的时候可以边加样边抬手,让液体自然靠近pcr板,这样能够减少组内差异哦。 ✅上机过程 ✅数据计算 得到qPCR结果后,去除不符合实验要求的孔(点击omit),在三组生物学重复中使用ΔΔCT法计算相对表达量。可以在表格里直接计算哦~ #研究生日常 #实验室日常 #poppy的科研生活 #qpcr #医学生
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【第十二集】PCR基因扩增仪的原理 一、原理 PCR技术的本质是体外核酸扩增,加热使双链DNA解开螺旋,在退火温度条件下引物同模板DNA杂交,在Taq DNA聚合酶,dNTPs,Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物,重复 “变性→退火→引物延伸”过程至25~40个循环,呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。 1. 普通的PCR仪 一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪,又叫传统的PCR仪。 用途:主要是做一些简单的、对单一退火温度的目的基因进行扩增。 (1)梯度PCR仪: 一次PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(温度梯度),通常为12种温度梯度的普通PCR仪。 用途:研究未知DNA退火温度的扩增。 (2)原位PCR:将具有细胞定位能力的原位杂交技术运用于从细胞内靶DNA的定位分析,在细胞内实现基因扩增的普通PCR仪。 用途:用于在细胞的靶DNA所在位置上进行基因扩增。 2. 实时荧光定量PCR仪 PCR扩增时加入的引物利用荧光素进行标记,使引物和荧光探针同时与模板进行特异性结合,扩增结果通过荧光信号采集系统实时采集信号并输送到计算机分析处理系统,实时输出量化结果,这样的PCR仪叫实时荧光定量PCR仪。 (1)金属板式实时定量PCR仪 可作为普通PCR仪使用 可带梯度功能 可容纳的样本量大,无需特殊耗材 温度均一性欠佳,有边缘效应,标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一 (2)离心式实时定量PCR仪 温度均一性较好 使用的是同一个激发光源和检测器,随时检测旋转到跟前的样品,有效减少系统误差 可容纳样品量少,有的需用特殊毛细管作样品管,增加了使用成本,也不带梯度功能 (3)各孔独立控温的定量PCR仪 不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块,各孔独立控温,适合多指标快速检测。 SmartCyclerⅡ的软件允许一台仪器同时操作六个样品模块,既满足高速批量要求,又能灵活运用,还可实现任意梯度反应。 SmartCyclerⅡ上样不如传统方法方便,而且需要独特的扁平反应管,使用成本较高。
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