离子交换层析基本过程分为四个步骤,固定相的调节或平衡、样品上样、洗涤、洗脱吸附分子。 1、第一步就是将固定相平衡到所需的起始条件,缓冲液的pH值和离子强度的选择是为了保证当样品上样时,蛋白质能与介质较好的结合时杂质尽可能的不结合。因此使用相同的缓冲液来平衡固定相。当达到平衡时,所有固定相带电基团都与可交换的反离子结合 2、第二步样品上样,蛋白质可以带净正电荷、带净负电荷和不带电荷。那带哪种电荷是通过比较每种蛋白质的PI值与和蛋白质所处的缓冲液pH来确定。蛋白质是由一条或者多条氨基酸残基长链组成的生物大分子,氨基酸含有氨基和羧基官能团,以及每个氨基酸特有的侧链。根据环境的PH,氨基被质子化带正电,羧基可以去质子化从而带负电,一些氨基酸的侧链会带正或者负电荷。由于质子的增加或者减少,所以分子上的净电荷可以使正也可以是负。等电点是蛋白质带中性电荷的pH值,当PH低于等电点时,蛋白质带净正电荷,高于则蛋白质带净负电荷。 3、第三步就是洗柱子,用最开始的缓冲液来清洗柱子,确保所有非结合蛋白都通过柱子。清洗好色谱柱后,改变条件来洗脱结合的蛋白, 4、清洗好色谱柱后,改变条件来洗脱结合的蛋白,可通过增加缓冲液的离子强度或者改变PH值来洗脱。随着盐离子浓度增加,盐离子与被束缚在介质表面的蛋白争夺电荷,电荷弱的会沿色谱柱向下移动。 在选定的PH下,具有最低净电荷的蛋白质会随着离子强度的增加首先从色谱柱中被洗脱,同样的,带有最高电荷的蛋白质将被牢牢保留,最后被洗脱。 #离子交换层析 #蛋白纯化 #缓冲液 #色谱柱 #科研
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离子交换色谱的详细实验步骤实验原理离子交换色谱基于目标分子(如蛋白质、核酸)与固定相(离子交换树脂)之间的电荷相互作用进行分离。阳离子交换色谱(CEX):固定相带负电(如磺酸基团),结合带正电的分子。阴离子交换色谱(AEX):固定相带正电(如季铵基团),结合带负电的分子。 通过调节缓冲液离子强度(盐浓度)或 pH 改变目标分子与树脂的结合能力,实现选择性洗脱。实验材料与试剂色谱柱预装柱(如 HiTrap SP Sepharose FF 阳离子柱,HiTrap Q Sepharose FF 阴离子柱)。空柱(可自填树脂,如 DEAE-Cellulose、CM-Sepharose)。缓冲液平衡缓冲液(低盐):20 mM Tris-HCl(pH 8.0,AEX)或 20 mM NaAc(pH 5.0,CEX)。洗脱缓冲液(高盐):平衡缓冲液 + 1 M NaCl(梯度洗脱)或特定盐浓度(阶段洗脱)。再生缓冲液:2 M NaCl。保存缓冲液:20%乙醇 + 0.1 M NaOH(长期保存)。仪器液相色谱系统(如 ÄKTA pure)或手动层析系统。UV检测器(监测 280 nm 吸光度)。馏分收集器、电导仪、pH计。 实验步骤一、柱子预处理与平衡柱子安装将色谱柱连接至系统,确保无气泡(轻拍柱体或反向冲洗)。用纯水冲洗 2 倍柱体积(CV),流速 1 mL/min。平衡柱子用 5–10 CV 平衡缓冲液冲洗,直至电导和 pH 稳定(电导值接近平衡缓冲液)。二、样品制备样品处理离心或过滤(0.22 μm 滤膜)去除颗粒物,避免堵塞柱子。透析或超滤置换样品缓冲液,使其与平衡缓冲液一致(离子强度 ≤50 mM)。上样体积柱载量参考树脂说明书(如 1 mL HiTrap 柱载量 10–20 mg 蛋白)。上样体积 ≤30% 柱体积(避免过载)。三、上样与结合上样操作流速:1–5 mL/min(根据柱子尺寸调整)。监测 UV 280 nm 基线,记录穿透峰(未结合蛋白)。冲洗未结合物用 5–10 CV 平衡缓冲液冲洗,直至 UV 信号回到基线。四、洗脱目标分子方法一:梯度洗脱(高分辨率)线性梯度设置洗脱程序:0–100% 洗脱缓冲液(含 1 M NaCl)梯度,5–10 CV。#生物实验室 #实验室出租 #生命科学 #生物实验 #细胞
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