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栀栀.1周前
质粒转染实验流程 一、实验准备 1、材料 目的质粒、待转染细胞、细胞培养基、无血清培养基、转染试剂、胰酶、PBS缓冲液、抗生素(可选)、细胞培养皿或培养板。 2、仪器 细胞培养箱、超净工作台、离心机、移液器、显微镜、CO₂培养箱。 二、实验步骤 1、细胞准备 1) 在转染前1天,使用胰酶消化处于对数生长期的细胞,用含10%胎牛血清的完全培养基重悬细胞,以合适密度接种于细胞培养皿或培养板中,确保转染时细胞汇合度达到70%-90%。 2) 将细胞置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养过夜。 2、转染复合物制备 1) 取两支无菌离心管,分别标记为A和B。 2) 在A管中加入适量无血清培养基,再加入一定量的质粒DNA,轻轻混匀。具体质粒用量根据细胞类型、转染试剂说明及实验目的确定,一般为1-5μg。 3) 在B管中加入等量无血清培养基,然后按照转染试剂说明书,加入相应体积的转染试剂,轻轻混匀,室温孵育5分钟。 4) 将A管中的DNA溶液逐滴加入B管的转染试剂溶液中,边加边轻轻混匀,室温孵育15-30分钟,使转染复合物充分形成。 3、转染 1) 从细胞培养箱中取出细胞培养皿或培养板,用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞2-3次,以去除残留的血清。 2) 向细胞中加入适量无血清培养基,使细胞完全浸没,再将制备好的转染复合物逐滴加入细胞培养皿或培养板中,轻轻晃动培养皿或培养板,使转染复合物均匀分布。 3) 将细胞放回37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养4-6小时。 4、更换培养基 1) 转染4-6小时后,从细胞培养箱中取出细胞,吸去含有转染复合物的无血清培养基。 2) 向细胞中加入适量含10%胎牛血清的完全培养基,继续在37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。 三、结果检测 1、荧光观察(针对带有荧光标记质粒) 转染24-48小时后,在荧光显微镜下观察细胞,统计发出荧光的细胞数量,计算转染效率。 2、蛋白检测(如Western blot) 转染48-72小时后,收集细胞,提取总蛋白,通过Western blot检测目的蛋白表达水平,分析转染效果。 细胞3、mRNA检测(如RT-qPCR) 收集转染后的细胞,提取总RNA,反转录为cDNA后,利用RT-qPCR检测目的基因mRNA表达量变化。 #细胞 #医学生 #科研 #实验 #科普
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