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周周6天前
双荧光素酶检测实验流程 一、实验准备材料 1、细胞株 根据研究目的选择合适细胞,提前复苏、传代培养。 2、质粒 含目的基因启动子或3'-UTR序列的萤火虫荧光素酶报告基因质粒,海肾荧光素酶表达质粒(内参)。 3、转染试剂 如Lipofectamine 3000等。 4、细胞培养相关试剂 DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液。 5、耗材 双荧光素酶检测试剂盒、6.96孔白色细胞培养板、无菌枪头、离心管等。 6、仪器 CO₂培养箱,设置为37℃、5%CO₂、超净工作台、酶标仪(具备检测荧光素酶活性功能)、离心机。 二、实验步骤细胞接种 1、实验前1天,将处于对数生长期细胞用胰蛋白酶消化,用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬,计数。 2、以每孔5×10³-1×10⁴个细胞密度接种到96孔白色细胞培养板,每孔加100μL培养基,轻轻混匀,避免产生气泡。 3、将培养板放入培养箱,培养过夜,使细胞贴壁且融合度达50%-70%。 三、转染 1、准备2个无菌离心管,按转染试剂说明书操作。一管中加入50μL无血清培养基,再加入适量萤火虫荧光素酶报告基因质粒和海肾荧光素酶表达质粒(两者比例通常为10:1,根据实验优化);另一管加50μL无血清培养基和适量转染试剂,轻轻混匀,室温孵育5分钟。 2、将两管液体混合,轻轻颠倒混匀,室温孵育20分钟,形成DNA-转染试剂复合物。 3、从培养箱取出细胞培养板,吸去原培养基,用PBS轻轻洗涤细胞2次。 4、每孔加入100μL含DNA-转染试剂复合物的无血清培养基,放入培养箱培养4-6小时。 5、4-6小时后,吸去含转染复合物培养基,每孔加入150μL完全培养基,继续培养24-48小时。 四、双荧光素酶活性检测 1、从培养箱取出96孔板,将其平衡至室温。2.按照双荧光素酶检测试剂盒说明书,在每孔加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂,轻轻混匀,室温孵育2-3分钟。 2、立即用酶标仪检测萤火虫荧光素酶活性,记录发光值。 3、检测完萤火虫荧光素酶活性后,每孔加入100μL海肾荧光素酶检测试剂,轻轻混匀,室温孵育2-3分钟。 4、用酶标仪检测海肾荧光素酶活性,记录发光值。 五、结果分析 1、计算每孔萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值(Firefly/Renilla),以消除转染
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