qpcr实验步骤视频版🔥 qPCR实验通过ΔΔCT法计算出flod change从而得到RNA在不同处理下的表达情况。那么实验过程是怎么样的呢?今天我们跟着视频一起来看一下吧~ ✅实验准备 提前准备好cDNA(模板)、引物、SYBR mix、ddH20、耗材等 Tip:在冰箱里长期放置的试剂会挥发或析出沉淀导致液体不均匀,所以试剂都需要先涡旋混均后离心才可以打开使用~在使用时候要记得轴对称配平和拧上保护盖哦~ ✅试剂配制 一般情况下配制20uL体系进行qPCR实验,为了节省试剂和样品,也可以配制成10uL体系哦~因为需要配制复孔(技术学重复)以减小误差,所以可以先将除了cDNA以外的试剂配完,分装到PCR板上,再逐一添加cDNA 试剂 体积 2x SYBR mix 5ul 引物F/引物R 0.25ul/0.25ul ddH20 2.5ul cDNA 单独加入2ul ✅PCR布板 每一行连续的三个孔(如A1、A2、A3)作为技术学重复,加入一模一样的体系和cDNA。可以在板子上先每三个画一条竖线区分。 给大家分享一个小技巧,做qpcr实验结果想要稳定就需要加样准确无误差的移液器,比如我们实验室就会单独放在一个实验台只进行定量实验,加样的时候可以边加样边抬手,让液体自然靠近pcr板,这样能够减少组内差异哦。 ✅上机过程 ✅数据计算 得到qPCR结果后,去除不符合实验要求的孔(点击omit),在三组生物学重复中使用ΔΔCT法计算相对表达量。可以在表格里直接计算哦~ #研究生日常 #实验室日常 #poppy的科研生活 #qpcr #医学生
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生物喵1月前
质粒构建实验流程 一、实验材料 1、准备目的基因 确定来源,可从cDNA文库、PCR扩增获取。载体:根据实验需求选择,如pUC系列、pET系列,确保有合适多克隆位点和筛选标记。 2、工具酶 限制性内切酶(如EcoR I、Hind III)、DNA连接酶(T4 DNA连接酶)。 3、其他试剂 DNA分子量标准、PCR试剂、琼脂糖、DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、LB培养基、氨苄青霉素或卡那霉素等抗生素。 4、仪器设备 PCR仪、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台。 二、目的基因获取 1、PCR扩增 根据目的基因序列设计引物,上下游引物5'端分别添加合适的限制性内切酶识别位点。以cDNA或基因组DNA为模板,进行PCR扩增。反应体系包含模板DNA、上下游引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液。 2、扩增程序 94℃预变性3-5分钟;94℃变性30秒,55-65℃退火30秒,72℃延伸1-2分钟/kb,共30-35个循环;最后72℃延伸5-10分钟。 3、PCR产物纯化 使用DNA凝胶回收试剂盒,切下含目的基因的PCR产物条带,按试剂盒说明书步骤进行回收,得到纯化的目的基因片段。 三、载体与目的基因双酶切反应体系配制 1、在无菌离心管中依次加入载体DNA、目的基因片段、10×限制性内切酶缓冲液、两种限制性内切酶,加ddH₂O补足体积。例如,总体积20μL体系中,载体DNA 1-2μg,目的基因适量,10×缓冲液2μL,每种酶各1μL,ddH₂O补齐至20μL。 2、将配制好的反应体系轻微混匀,短暂离心后,置于37℃恒温培养箱或水浴锅中孵育2-4小时。 3、取适量酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,与DNA分子量标准对比,确认酶切是否成功及片段大小是否正确。 四、连接反应体系配制在无菌离心管中依次加入酶切后的载体片段、目的基因片段、10×T4 DNA连接酶缓冲液、T4 DNA连接酶,加ddH₂O补足体积。例如,10μL体系中,载体与目的基因摩尔比1:3-1:10(根据实际情况调整),10×缓冲液1μL,T4 DNA连接酶1μL,ddH₂O补齐至10μL。 将反应体系轻微混匀,短暂离心后,16℃连接过夜或根据连接酶说明书设置条件。 #科普 #实验 #医学科普 #科研 #科研人的精神状态
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PCR、QPCR、RT-PCR全教程 最近有小伙伴想要PCR教程 那就直接上相关步骤手册吧! 大致过程 RNA反转录合成cDNA,以cDNA为模板经过变性(让cDNA能够充分打开)、 退火(让引物结合到模板DNA上)和延伸(让DNA聚合酶(Taq酶)开始合成DNA, 让新的DNA链按照模板的碱基顺序延长下去)等过程扩增出很多的目的片段。 1. RNA抽提 方法:TRlzol法。 主要成分:苯酚(具有裂解细胞和变性蛋白的作用)。 RNA抽提前准备:试剂耗材准备(注意RNase free)、样品的准备。 步骤:样品+1ml TRlzol室温裂解10min+200μL氯仿振荡30s后室温静置2-3 min;4℃低温离心(12 000g×20min);400μL上层水相+600μL异丙醇室温 沉淀10min;4℃低温离心(12 000g×20min);75%乙醇冲洗;晾干沉淀, DEPC-treated水溶解。 2. RNA 质量检测 方法:分光光度计测定、凝胶电泳法 3. 反转录 是以RNA为模板合成cDNA的过程。在这个过程中遗传信息的流动方向和转 录时相反,所以称为“反转录”。在这个过程中需要一个反转录酶,合成的DNA 称为与RNA互补的DNA(complementary DNA, cDNA)。这个过程中根据 不同的情况选择不同的反转录引物,如果要检测的RNA有poly A尾巴,可以 用Oligo(dT)做反转录引物;如果要检测的RNA没有poly A尾巴,就用随机引 物(random primer)来反转;如果要检测的RNA序列已知,可用特定引物 (specific primer)来反转。 4. PCR程序 三步法: 第一步:94℃变性30s; 第二步(循环30-35次):94℃变性30s,55-60℃退火30s,72℃延伸24s(时 间按照合成速度和长度来计算); 第三步:72℃终止延伸5-10min。 #医学生#研究生 #PCR #qpcr #rtpcr
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啊会4周前
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