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生物喵1月前
质粒构建实验流程 一、实验材料 1、准备目的基因 确定来源,可从cDNA文库、PCR扩增获取。载体:根据实验需求选择,如pUC系列、pET系列,确保有合适多克隆位点和筛选标记。 2、工具酶 限制性内切酶(如EcoR I、Hind III)、DNA连接酶(T4 DNA连接酶)。 3、其他试剂 DNA分子量标准、PCR试剂、琼脂糖、DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、LB培养基、氨苄青霉素或卡那霉素等抗生素。 4、仪器设备 PCR仪、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台。 二、目的基因获取 1、PCR扩增 根据目的基因序列设计引物,上下游引物5'端分别添加合适的限制性内切酶识别位点。以cDNA或基因组DNA为模板,进行PCR扩增。反应体系包含模板DNA、上下游引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液。 2、扩增程序 94℃预变性3-5分钟;94℃变性30秒,55-65℃退火30秒,72℃延伸1-2分钟/kb,共30-35个循环;最后72℃延伸5-10分钟。 3、PCR产物纯化 使用DNA凝胶回收试剂盒,切下含目的基因的PCR产物条带,按试剂盒说明书步骤进行回收,得到纯化的目的基因片段。 三、载体与目的基因双酶切反应体系配制 1、在无菌离心管中依次加入载体DNA、目的基因片段、10×限制性内切酶缓冲液、两种限制性内切酶,加ddH₂O补足体积。例如,总体积20μL体系中,载体DNA 1-2μg,目的基因适量,10×缓冲液2μL,每种酶各1μL,ddH₂O补齐至20μL。 2、将配制好的反应体系轻微混匀,短暂离心后,置于37℃恒温培养箱或水浴锅中孵育2-4小时。 3、取适量酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,与DNA分子量标准对比,确认酶切是否成功及片段大小是否正确。 四、连接反应体系配制在无菌离心管中依次加入酶切后的载体片段、目的基因片段、10×T4 DNA连接酶缓冲液、T4 DNA连接酶,加ddH₂O补足体积。例如,10μL体系中,载体与目的基因摩尔比1:3-1:10(根据实际情况调整),10×缓冲液1μL,T4 DNA连接酶1μL,ddH₂O补齐至10μL。 将反应体系轻微混匀,短暂离心后,16℃连接过夜或根据连接酶说明书设置条件。 #科普 #实验 #医学科普 #科研 #科研人的精神状态
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