测定蛋白的方法有多种,其优缺点也各不相同,目前常用的测定蛋白浓度的方法主要包括:紫外分光光度法、双缩脲法、Lowry法、Bradford法、BCA法、磺基水杨酸法、荧光染料定量法。其中目前我司常用以下3种方法测定蛋白浓度: 1、紫外分光光度法 检测原理:蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环中含有共轭双键,因此,蛋白质具有吸收紫外光的性质,其最大吸收峰位于280nm附近。在最大吸收波长处,吸光度与蛋白质溶液的浓度服从郎伯-比尔定律。 在使用此方法时,由于不同蛋白的序列不同,其所含有的酪氨酸和色氨酸所占总氨基酸的比例不同,因此造成了不同的蛋白具有不同的消光系数。在使用该方法进行测定蛋白浓度时,需要知道待测蛋白的消光系数,将通过紫外分光光度计测得的浓度除以蛋白的消光系数即为该蛋白的真实浓度。 2、BCA法 检测原理:BCA法基于双缩脲原理,碱性条件下蛋白质将Cu2+还原成Cu+,再使用BCA鳌合Cu+作为显色剂,产生蓝紫色并在562nm有吸收峰,颜色的深浅与蛋白质呈剂量相关性,可以根据在562nm处的吸光度计算待测蛋白浓度。 优点:①.灵敏度高,检测浓度下限达到25μg/ml,最小检测蛋白量达到0.5μg;②.不易受一般浓度去污剂的干扰,抗干扰能力强。③.在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。 缺点:会受螯合剂及高浓度还原剂的影响。 3、Bradford法 检测原理:考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕红色,最大吸收峰在465nm,当与蛋白质结合时变为蓝色,其最大吸收峰移至595nm,而且消光系数更大,在一定范围内反应液在595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比,此时测定595nm处吸光度可以对蛋白进行定量;蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。(染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合) #检测蛋白浓度 #BCA #Lowry #紫外分光光度计 #Bradford
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