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EnkiLife1年前
Western Blot(WB,蛋白质印迹法)原理及实验操作 WB(Western Blot)是一种用于检测特定蛋白质的实验室技术,结合了凝胶电泳(如SDS-PAGE)和免疫检测(使用抗体),能够检测和量化样本中的特定蛋白质。以下是Western Blot的基本步骤: 1. 样本准备 细胞或组织裂解:将细胞或组织样本裂解,释放蛋白质。 蛋白定量:使用Bradford法或BCA法等方法测定蛋白浓度,确保各样本蛋白上样量一致。 2. 蛋白质分离 SDS-PAGE电泳:将样本中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离,根据分子量大小将蛋白质分离开。 3. 转膜 转膜:将分离的蛋白质从凝胶转移到固相支持物(如硝酸纤维素膜或PVDF膜)上。 4. 封闭 封闭膜:用封闭液(如5%脱脂奶粉或BSA)封闭膜上的非特异性结合位点,防止抗体非特异性结合。 5. 一抗孵育 一抗孵育:将膜与特异性一抗孵育,一抗与目标蛋白质结合。 6. 洗涤 洗涤膜:用洗涤缓冲液(如TBST)多次洗涤膜,去除未结合的一抗。 7. 二抗孵育 二抗孵育:将膜与二抗孵育,二抗与一抗结合。二抗通常与辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)等酶连接。 8. 再次洗涤 再次洗涤膜:用洗涤缓冲液多次洗涤膜,去除未结合的二抗。 9. 化学发光检测 化学发光底物:将化学发光底物(如鲁米诺)加入到膜上,酶催化底物产生化学发光反应。 成像:使用成像系统(如CCD相机)捕获发光信号,生成蛋白质条带的图像。 10. 分析 分析条带:通过分析条带的强度和位置,确定目标蛋白质的表达水平和分子量。 #Westernblot #westernblot实验原理 #westernblot实验步骤 #WB实验原理及操作步骤 #2024抖音生活记忆
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生物喵2月前
WB实验常见问题及解决办法 Western Blot(WB)实验即蛋白质免疫印迹实验,以下是一些WB实验的常见问题及解决办法: 一、条带不出现 1、原因 抗体问题(如效价低、特异性差、孵育条件不当);蛋白上样量不足或蛋白降解;转膜效率低或未成功转膜。 2、解决办法 更换高质量抗体,优化抗体孵育条件;增加蛋白上样量,注意蛋白提取和保存条件,使用蛋白酶抑制剂;优化转膜条件,如调整转膜时间、电流、电压,检查转膜装置是否正确组装。 二、条带出现非特异性杂带 1、原因 抗体特异性差;封闭不充分;洗膜不彻底。 2、解决办法 选择特异性高的抗体,进行预实验筛选;延长封闭时间或更换封闭液,如用5%脱脂奶粉或BSA;增加洗膜次数和时间,适当提高洗膜液中Tween-20的浓度。 三、条带信号弱 1、原因 抗体量不足或亲和力低;蛋白表达量低;曝光时间过短。 2、解决办法 增加一抗和二抗的浓度或延长孵育时间,选择亲和力高的抗体;优化蛋白提取方法,进行蛋白浓缩,必要时通过基因转染等方法提高蛋白表达量;适当延长曝光时间。 四、条带出现拖尾现象 1、原因 样品上样量过大;凝胶浓度不合适;蛋白降解或聚集。 2、解决办法 减少上样量;根据蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度;确保蛋白提取过程中避免蛋白降解,可使用超声处理等方法打散蛋白聚集体。 五、条带出现背景过高 1、原因 封闭不充分;抗体浓度过高或孵育时间过长;洗膜不充分。 2、解决办法 优化封闭条件;降低抗体浓度或缩短孵育时间;增加洗膜次数和时间,确保充分洗去未结合的抗体。 六、条带变形或扭曲 1、原因 凝胶制备不均匀;电泳过程中温度过高;转膜时膜与胶贴合不紧密。 2、解决办法 制备凝胶时确保试剂均匀混合,凝胶凝固环境稳定;电泳时可使用冷却装置,控制温度;转膜时排除气泡,确保膜与胶紧密贴合,可使用转膜夹固定。 #科普 #实验 #医学科普 #医学生 #科研人的精神状态
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