条带这样看!DNA pull-down实验结果解读来啦~ 在科研实验中,DNA pull - down 技术是研究 DNA 与蛋白质相互作用的重要手段。但 做完实验,怎么看结果可是关键! 今天就带大家深入了解一下 DNA pull - down 实验结果的解读方法~ 实验前的检测 在正式实验前,我们可以先通过 WB(蛋白质免疫印迹)检测预期的猎物蛋白的本底表达量。 这一步就像给猎物蛋白 “摸摸底”,要是表达水平太低,pull - down 后可能检测不到,就容易误判成假阴性结果。所以如果发现表达量低,建议在样本中过表达后再尝试,同时还能借此判断样本中蛋白是否已经发生降解。 要是没有 WB 条件或需求,也别慌,通过考染也能判断蛋白提取质量,考染的结果能让我们对蛋白的情况心里有数。 DNA 探针扩增结果 扩增好的 DNA 探针需要通过凝胶电泳来判断扩增是否完全。 这里要注意哦,未标记的 DNA 探针作为对照组,生物素标记的 DNA 作为实验组。凝胶电泳的结果就像一张 “成绩报告单”,能直观地告诉我们 DNA 探针扩增得怎么样。 实验后的检测 pull - down 后,我们再次通过 WB 检测猎物蛋白。 如果实验组能检测到猎物蛋白目的条带,而对照组没有,这就好比在 “大海捞针” 中成功捞到了我们想要的 “针”,说明该蛋白能与诱饵 DNA 特异性结合。 但要是都没有检测到,那就说明该蛋白不能与诱饵 DNA 结合。 另外,银染通常作为质谱送样上机前的质控,能检测 pull - down 后蛋白液的质量。在知道预期蛋白大小的前提下,还能切胶送质谱进一步分析。 在我们的视频里,会对这些结果解读的要点进行更详细的讲解,结合实际案例和图示,让复杂的知识变得超容易理解。 不管你是科研小白还是专业人士,都能从中学到新知识。 快打开视频,一起探索 DNA pull - down 实验结果的奥秘吧!
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水金鱼1月前
酵母双杂交实验流程 酵母双杂交实验是一种用于研究蛋白质相互作用的分子生物学技术,以下是其基本实验流程: 一、载体构建-获取目的基因 通过PCR等方法从相应的DNA模板中扩增出编码待研究蛋白质的基因序列。 二、构建诱饵载体 将目的基因克隆到含有酵母转录因子DNA结合结构域(BD)的载体上,构建成诱饵载体。 三、构建猎物载体 将可能与诱饵蛋白相互作用的蛋白质的基因克隆到含有酵母转录因子激活结构域(AD)的载体上,得到猎物载体。 四、酵母菌株的选择与准备 1、选择合适的酵母菌株 根据实验需求选择合适的酵母菌株,常见的有Y2HGold等菌株。 2、酵母感受态细胞的制备 采用化学方法或电转化法将酵母细胞制备成感受态细胞,以便于后续的载体转化。 3、转化酵母细胞-共转化 将构建好的诱饵载体和猎物载体同时转化到酵母感受态细胞中。 4、筛选阳性转化子 利用载体上携带的筛选标记,如营养缺陷型标记,在相应的筛选培养基上筛选出同时含有诱饵载体和猎物载体的阳性转化子。 五、相互作用检测 1、报告基因检测 如果诱饵蛋白和猎物蛋白发生相互作用,会使酵母转录因子的BD和AD结构域相互靠近,从而激活报告基因的表达。通过检测报告基因的表达情况,如β-半乳糖苷酶活性、荧光素酶活性等,来判断蛋白质之间是否发生相互作用。 2、酵母表型分析 有些报告基因的表达会导致酵母细胞在特定培养基上出现生长或颜色变化等表型,通过观察酵母细胞的表型来判断蛋白质相互作用。 六、结果验证 1、重复实验 为确保结果的可靠性,需要进行多次重复实验。 2、其他实验验证 采用其他技术如免疫共沉淀、GST-pull down等实验进一步验证蛋白质之间的相互作用。 #生物医学 #医学生 #酵母双杂交 #医学生 #实验外包
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📚免疫共沉淀Co-IP实验步骤➕结果解读!免疫共沉淀(Co-IP)是研究蛋白质相互作用的常用方法,今天就来给大家分享Co-IP实验的详细步骤和结果解读,快拿起小本本记下来吧!📘 🌈实验原理 ✔️抗原-抗体特异性结合:抗体特异性识别并结合目标蛋白质。 ✔️蛋白质复合物形成:目标蛋白质与其他蛋白质形成复合物,抗体结合后整个复合物被沉淀。 ✔️沉淀与洗涤:使用Protein A或Protein G等固相载体沉淀抗体及复合物,洗涤去除非特异性结合的蛋白质。 ✔️分析相互作用蛋白:通过SDS-PAGE分离,考马斯亮蓝染色或Western blotting鉴定相互作用蛋白。 🌈实验步骤 1️⃣细胞培养与裂解: 培养细胞至合适密度,选择6孔板或T25/T75培养瓶。 过表达兴趣基因,裂解细胞,收集上清,切记不可超声。 2️⃣抗体孵育: 使用诱饵蛋白的IP级抗体,4℃摇床孵育过夜。 留取蛋白裂解液进行WB,称作Input。 3️⃣免疫共沉淀: 加入Protein A/G磁珠,4℃摇床孵育过夜。 预处理磁珠,使用BSA减少非特异性结合。 4️⃣免疫沉淀物富集: 利用磁力架富集磁珠,强酸洗脱,煮沸后SDS-PAGE/WB检测。 🌟常用术语 ✔️Input:全蛋白溶液,用于检测诱饵蛋白与靶蛋白表达。 ✔️IgG:抗体对照,证明抗体特异性。 ✔️IP:免疫沉淀使用的抗体。 ✔️IB:免疫印迹WB实验结果。 🌈结果解读 🔎样品类型:使用人和大鼠样品。 🔎细胞处理:处理四组细胞样品。 🔎抗体选择:使用P65抗体,检测与P65相互作用的CDK9。 🔎Input验证:证明全蛋白溶液中存在P65、CDK9,β-actin作内参。 💡【DLab实验中心】注意事项 ⭕️抗体选择:确保抗体适用于Co-IP。 ⭕️磁珠处理:磁珠容易聚团,需使用旋转仪辅助。 ⭕️洗脱条件:强酸洗脱时注意pH值和时间。 ⭕️抗体重链轻链:若目的条带与重链或轻链位置重叠,需使用不含重链或轻链的HRP二抗。 #科研日常#实验#研究生#科研实验#实验人
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生物喵2月前
EMSA检测实验流程凝胶迁移实验 用于研究蛋白质与特定DNA或RNA序列的相互作用。 一、实验准备 1. 实验材料纯化的蛋白质样品、标记的核酸探针(可以是放射性标记如^{32}P,或非放射性标记如生物素)、结合缓冲液(含Tris-HCl、MgCl₂、EDTA、DTT、甘油、BSA等,pH通常7.5-8.0)、聚丙烯酰胺凝胶(依据核酸片段大小选择合适浓度,一般4-10%)、电泳缓冲液(如0.5×TBE)、上样缓冲液(含甘油、溴酚蓝等)、脱色液(乙醇:乙酸:水=10:1:89)、显影液(若使用放射性标记)或链霉亲和素-HRP及化学发光底物(若使用生物素标记)。 2. 实验设备垂直电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统(非放射性标记用)、放射自显影设备(放射性标记用)、离心机、水浴锅或PCR仪。 二、实验步骤 1. 探针标记若使用非放射性标记,按照生物素标记试剂盒说明书,将生物素标记到核酸探针上;若是放射性标记,在合适反应体系中,利用激酶等将^{32}P标记到探针末端,标记后通过柱层析等方法纯化探针 。 2. 蛋白质-核酸结合反应在微量离心管中依次加入适量结合缓冲液、蛋白质样品(设不加蛋白的对照组)、标记的核酸探针,轻轻混匀,总体积一般为10-20μL。室温或特定温度(依据研究的蛋白-核酸相互作用特性,常见25℃孵育20-30分钟,促进蛋白质与核酸结合形成复合物。 3. 聚丙烯酰胺凝胶制备根据实验需求,选择合适浓度的聚丙烯酰胺凝胶,按比例混合丙烯酰胺、双丙烯酰胺、TBE缓冲液、过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMED),快速混匀后灌胶,插入梳子,待凝胶凝固。 4. 上样与电泳在结合反应体系中加入适量上样缓冲液,混匀后上样到凝胶孔中。在0.5×TBE缓冲液中进行电泳,设置合适电压(如100 - 150V),使游离探针与蛋白质-核酸复合物有效分离,溴酚蓝迁移至凝胶底部附近结束电泳。 5. 转膜(非放射性标记适用):若为非放射性标记,电泳结束后将凝胶中的核酸-蛋白质复合物转移到尼龙膜上,可采用半干转或湿转法,转膜条件依据转膜仪说明书设置。 6. 检测非放射性标记转膜后的尼龙膜用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1小时,洗膜后与链霉亲和素-HRP孵育1小时,再次洗膜,加入化学发光底物,在凝胶成像系统中曝光成像。 #实验室日常 #实验室 #科研 #科研狗的日常 #实验
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147.零基础掌握分子对接蛋白配体相互作用分析完整指南 新药研发的漫长征途中,如何从成千上万种化合物中高效筛选出能打开疾病“锁芯”的那把“金钥匙”?本课程将带你走进计算机辅助药物设计(CADD)的核心技术——分子对接(Molecular Docking)。我们将摒弃枯燥的理论堆砌,通过全流程的实战案例,手把手教你如何在计算机的虚拟世界中预测药物与靶点的相互作用。 你将学到什么: 🔓 核心原理通俗解构:深入浅出地理解微观世界的“锁钥模型”,掌握受体(蛋白)与配体(小分子)的相互作用机制。 💎 数据筛选专家级技巧(核心亮点): 掌握 PubChem 小分子数据的正确获取方式(SDF格式)。 独家秘以此: 详解 PDB 蛋白结构筛选的 “5大黄金标准”——从分辨率(Resolution)到配体状态(Holo vs Apo),教你避开“垃圾数据”,选出最完美的对接模板。 🛠️ 全流程工具实操:利用对新手友好的在线工具 CB-Dock,完成从文件预处理、参数设置到盲对接(Blind Docking)的完整操作。 📊 结果深度解读:学会像审稿人一样看数据,读懂 Vina Score(结合能)、锁定结合位点,并分析氢键与疏水作用等关键结合模式。 适用人群: 生物学、药学、化学相关专业的本科生及研究生。 对计算机辅助药物设计感兴趣,希望快速掌握一项科研“硬技能”的零基础初学者。 希望为湿实验提供理论依据和方向指导的科研人员。 课程特色: 不讲复杂的编程代码,只讲好用的实战策略。从数据源头的筛选逻辑到最终的结果分析,一站式打通分子对接全流程!
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