制备PBMC效果为什么总是不好 PBMC,是指外周血中具有单个核的细胞, 我们可以用人或动物供体的外周血,经过Ficoll密度梯度离心法进行制备 整个操作流程相对简单 首先将新鲜的外周血稀释,加到Ficoll试剂上层。然后离心。 离心结束后,即可得到四分层的样本 其中第二层薄薄的白膜层即PBMC 吸出最上层的血浆层,再将白膜层吸出。 洗涤一遍,就可以得到纯化的PBMC。 操作看起来很简单,但为什么很多人做出的结果,就是不好呢 比如没有明显的白膜层,有红细胞,活率低等问题 今天给大家总结一个详细的操作方案 首先需要准备新鲜的外周血样本,PBS、分离液、离心管和巴氏吸管。 【分离液的工作温度为20℃左右,温度变化会使溶液密度改变,影响分离效果。】 先将外周血用PBS 1:1稀释,然后缓慢加到Ficoll试剂上层。 【外周血尽量使用24小时内采集的血样,3小时内的样本可以常温保存,3小时以上的样本需要2-8℃保存】 【稀释后的血样可以使加样更简单,也能提高分离的得率】 加样的时候可以将离心管微微倾斜,然后慢慢将血样加到分离液上层。 【开始加样时,可以通过滴加的方式,让血样和分离液分层。然后再慢慢加快速度。】 接着我们离心,离心设置650 x g,20分钟,升速我们设置为1,降速我们设置为0。 【注意慢升慢降,保证血样缓慢分层。如果升降速设置错误,就会导致血样与分离液混合,无法形成分层。】 离心结束后,即可得到四分层的样本 【从上到下分别为:血浆层、白膜层、分离液层和红细胞层。其中第二层薄薄的白膜层即PBMC】 吸出最上层的血浆层,再将白膜层吸出,转移到一个新的离心管内。加入PBS洗涤一遍,就可以得到纯化的PBMC。 【吸出白膜层的时候尽量避免吸到分离液,分离液层含有红细胞和粒细胞,会导致最后的细胞沉淀偏红】 【血浆层含有血小板,血小板可以通过洗涤和PBMC分离】 #细胞 #科研 #实验 #外周血 #实验室日常
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