珍贵细胞株在细胞培养过程中被细菌污染的急救方案! 在细胞培养的过程中,最让人头疼的莫过于细菌污染——尤其是对于那些构建周期长、尚未保种的珍贵细胞株,如Sg单克隆株、耐药株等。一旦污染发生,多年的心血可能毁于一旦。不过别急着放弃!如果你的细胞虽然遭遇大面积污染,但状态尚可、形态未见明显异常,或许还有抢救的机会! 今天,我们就为大家整理出一套针对此类珍贵细胞株细菌污染的“急救方案”。请注意,本方法主要适用于来源困难、构建耗时的珍贵细胞,常规工具细胞或易获取细胞不建议采用此类处理。 一、抢救前准备 PBS 胰酶 可乐必妥(0.5%左氧氟沙星滴眼液,无菌原装,超净台内分装使用) 完全培养基(需经0.22 μm滤膜过滤,防止二次污染) 二、操作步骤 1、弃去原有培养基,用PBS轻轻润洗细胞3–4次,尽量洗去浮游细菌。 2、加入胰酶进行消化。注意控制时间,以细胞未完全脱落而细菌已大量悬浮为宜,通常为正常消化时间的一半。 3、在显微镜下观察,见到细菌呈悬浮流动、细胞仍贴壁时,即可终止消化。 4、不要吹打细胞!将培养皿稍倾斜,用移液器轻轻吸除胰酶。 5、沿壁缓慢加入PBS,轻柔润洗细胞表面,进一步去除残留细菌,重复2–3次。 6、加入完全培养基,温和吹打使细胞脱落,收集细胞悬液,离心后弃去上清。 7、用新鲜全培重悬细胞,并移入新培养器皿,同时按1:500比例加入0.5%左氧氟沙星滴眼液,置于培养箱过夜处理。 8、第二天观察:若培养液无浑浊,说明抢救初步成功;若仍有污染迹象,可尝试将左氧氟沙星以1:1000比例再次加入,继续杀菌。 9、抢救成功后务必及时撤除抗生素,避免长期使用影响细胞状态。 温馨提示 该方法适用于紧急处理细菌污染,但并不能保证100%成功,后续需密切观察细胞状态,并尽快进行保种。预防优于补救,日常实验中的无菌操作才是避免污染的根本!如果你正在为珍贵细胞污染而焦虑,不妨尝试以上方法,或许能帮你挽回一株珍贵的细胞!#微生物菌种查询网 #细胞培养 #微生物检验 #有趣的知识又增长了#涨知识#科普#省流 #拒绝废话#科普#冷知识#省流
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生物喵3月前
稳转细胞株筛选实验流程 一、实验准备 1、实验材料 目的细胞系、含有目的基因及抗性基因的表达载体(如质粒)、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、感受态大肠杆菌、无内毒素质粒提取试剂盒、细胞培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、抗生素(如嘌呤霉素、G418等,根据载体抗性选择)、Lipofectamine 3000转染试剂、Opti-MEM培养基、六孔板、细胞培养瓶等。 2、仪器设备 离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、酶标仪。 二、载体构建(若已有构建好的载体可跳过此步) 1、获取目的基因 从基因文库购买或通过PCR扩增获取目的基因,设计引物时引入合适的限制性内切酶位点。 2、酶切载体与目的基因 用相应的限制性内切酶分别对表达载体和目的基因进行双酶切,37℃孵育2-4小时。 3、连接反应 将酶切后的载体与目的基因按合适比例混合,加入T4 DNA连接酶,16℃连接过夜。 4、转化大肠杆菌 将连接产物转化至感受态大肠杆菌中,冰浴30分钟,42℃热激90秒,再冰浴2分钟后加入无抗生素LB培养基,37℃振荡培养1小时。 5、筛选阳性克隆 将菌液涂布于含相应抗生素的LB平板上,37℃培养过夜。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定,将阳性克隆扩大培养后提取质粒,进行酶切和测序验证。 三、细胞培养 1、复苏细胞 从液氮罐中取出细胞冻存管,迅速放入37℃水浴锅中解冻,转移至含有完全培养基的离心管中,1000 rpm离心5分钟,弃上清,加入适量完全培养基重悬细胞,接种至细胞培养瓶中,置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。 2、传代细胞 当细胞密度达到80%-90%时,弃去旧培养基,用PBS冲洗细胞2次,加入适量胰蛋白酶消化液,37℃孵育1-2分钟,显微镜下观察细胞变圆脱落后,加入完全培养基终止消化,吹打均匀后按1:3-1:5的比例传代。 #实验 #医学生 #实验室日常 #科研狗的日常 #科研
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生物喵3月前
细胞活性氧(ROS)检测实验流程 一、实验材料 1、细胞样本 根据实验目的选择合适细胞系,如HeLa细胞、RAW264.7细胞等,在适宜条件下培养至对数生长期。 2、试剂 ROS荧光探针(如DCFH-DA)、细胞培养液、胰蛋白酶、PBS缓冲液、阳性对照试剂(如过氧化氢)。 3、仪器设备 细胞培养箱、离心机、荧光显微镜、酶标仪、移液器及配套枪头、96孔板或细胞培养皿。 二、实验准备 1、细胞准备 取对数生长期细胞,用胰蛋白酶消化后,以合适密度接种于96孔板(每孔约5×10³-1×10⁴个细胞)或细胞培养皿,放入细胞培养箱(37℃、5%CO₂)培养,待细胞贴壁且融合度达70-80%进行后续实验。 2、试剂准备 将DCFH-DA探针用无水乙醇配制成10 mM储存液,避光保存,使用前用细胞培养液稀释至所需工作浓度(一般为10-20μM)。 3、对照组准备 用细胞培养液将阳性对照试剂过氧化氢稀释至合适浓度(如1 mM),作为阳性对照组诱导ROS产生。 三、实验步骤 1、分组处理 将细胞分为空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和实验组。空白对照组不做任何处理;阴性对照组加入等体积培养液;阳性对照组加入过氧化氢;实验组加入待检测药物或刺激物。每个组设置3-5个复孔,放入培养箱孵育合适时间(根据实验目的确定,一般为1-6小时)。 2、加载荧光探针 孵育结束后,吸去各孔培养液,用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2-3次,以去除残留培养液和杂质。每孔加入含DCFH-DA工作液的无血清培养液,放入培养箱避光孵育20-30分钟。 3、检测荧光强度 孵育结束后,再次用PBS洗涤细胞2-3次,去除未进入细胞的探针。 4、荧光显微镜观察 将细胞培养皿置于荧光显微镜下,选择合适激发和发射波长(DCFH-DA激发波长约488 nm,发射波长约525 nm),观察并拍照记录细胞荧光强度和分布。 5、酶标仪检测 若使用96孔板,直接将板放入酶标仪,设置相同波长参数,检测各孔荧光强度值,以相对荧光强度表示细胞内ROS水平。 #实验 #知识科普 #科普 #医学科普 #科研人的精神状态
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