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412.单细胞分析更新scRNAtoolVis和虚拟敲除 质控过滤 → decontX去污染 →DoubletFinder去双细胞 → 标准化与高变基因筛选 → PCA降维 → 聚类 → UMAP可视化 → SingleR细胞注释 → 分组与差异分析 →scRNAtoolVis可视化 → 基因虚拟敲除 使用的R包包括:Seurat(单细胞数据处理与分析)、celda(decontX环境RNA去污染)、DoubletFinder(双细胞检测与去除)、SingleR和celldex(自动细胞类型注释)、clustree(多分辨率聚类评估)、scRNAtoolVis和ggunchull(单细胞特色可视化)、plot1cell和circlize(环形UMAP可视化)、scTenifoldKnk(基因虚拟敲除模拟)、ComplexHeatmap(热图绑制)、ggsci(科学期刊配色)、ggplot2、ggpubr、patchwork、ggrepel(统计绑图与图形组合)、dplyr和tidyr(数据处理)、rstatix(统计检验)。原始计数矩阵经Seurat创建分析对象,设定基因至少在10个细胞中表达、每个细胞至少表达30个基因。质量控制阶段,过滤每个细胞表达基因数低于20的低质量细胞,并去除线粒体基因比例超过20%的细胞。随后使用celda包中的decontX算法去除环境RNA污染,过滤污染比例超过50%的细胞。使用DoubletFinder进行双细胞检测,通过paramSweep自动确定最优pK值,根据细胞数量估算双细胞率(每1000细胞约0.8%),去除鉴定为双细胞的细胞。数据经LogNormalize方法标准化(缩放因子10000),采用VST方法筛选1500个高变基因,进行数据缩放后执行PCA降维(计算20个主成分)。通过JackStraw检验(100次重采样)和累积方差贡献率(阈值90%)确定用于下游分析的主成分数(13个)。基于选定的主成分构建KNN图,使用Louvain算法进行细胞聚类(分辨率0.2),并通过clustree评估0.1至1.0范围内多分辨率聚类的稳定性。采用UMAP算法进行非线性降维可视化。细胞类型注释使用SingleR包,以HumanPrimaryCellAtlasData为参考数据集,在聚类水平进行自动注释,并将注释结果映射至单个细胞。根据细胞名称前缀将细胞分为对照组(control)和疾病组
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