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生物喵5月前
细胞活性氧(ROS)检测实验流程 一、实验材料 1、细胞样本 根据实验目的选择合适细胞系,如HeLa细胞、RAW264.7细胞等,在适宜条件下培养至对数生长期。 2、试剂 ROS荧光探针(如DCFH-DA)、细胞培养液、胰蛋白酶、PBS缓冲液、阳性对照试剂(如过氧化氢)。 3、仪器设备 细胞培养箱、离心机、荧光显微镜、酶标仪、移液器及配套枪头、96孔板或细胞培养皿。 二、实验准备 1、细胞准备 取对数生长期细胞,用胰蛋白酶消化后,以合适密度接种于96孔板(每孔约5×10³-1×10⁴个细胞)或细胞培养皿,放入细胞培养箱(37℃、5%CO₂)培养,待细胞贴壁且融合度达70-80%进行后续实验。 2、试剂准备 将DCFH-DA探针用无水乙醇配制成10 mM储存液,避光保存,使用前用细胞培养液稀释至所需工作浓度(一般为10-20μM)。 3、对照组准备 用细胞培养液将阳性对照试剂过氧化氢稀释至合适浓度(如1 mM),作为阳性对照组诱导ROS产生。 三、实验步骤 1、分组处理 将细胞分为空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和实验组。空白对照组不做任何处理;阴性对照组加入等体积培养液;阳性对照组加入过氧化氢;实验组加入待检测药物或刺激物。每个组设置3-5个复孔,放入培养箱孵育合适时间(根据实验目的确定,一般为1-6小时)。 2、加载荧光探针 孵育结束后,吸去各孔培养液,用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2-3次,以去除残留培养液和杂质。每孔加入含DCFH-DA工作液的无血清培养液,放入培养箱避光孵育20-30分钟。 3、检测荧光强度 孵育结束后,再次用PBS洗涤细胞2-3次,去除未进入细胞的探针。 4、荧光显微镜观察 将细胞培养皿置于荧光显微镜下,选择合适激发和发射波长(DCFH-DA激发波长约488 nm,发射波长约525 nm),观察并拍照记录细胞荧光强度和分布。 5、酶标仪检测 若使用96孔板,直接将板放入酶标仪,设置相同波长参数,检测各孔荧光强度值,以相对荧光强度表示细胞内ROS水平。 #实验 #知识科普 #科普 #医学科普 #科研人的精神状态
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