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小白必看|ELISA全流程指南|从准备到分析 🔥科研党福音|威奥生物ELISA操作全流程,手把手教你避坑出图!🔥 做ELISA总是白板?标准曲线拉不直?实验间CV飘上天? 今天就把上海威奥生物经典的SABC夹心法ELISA全流程掰碎讲透,从样本处理到数据分析,一篇搞定,赶紧❤️收藏! 🧪【实验前准备别踩雷】 ▪️ 血清/血浆:离心要彻底(3000×g, 20min, 4℃),避免溶血和血脂 ▪️ 组织匀浆:加蛋白酶抑制剂,液氮研磨后高速离心取上清 ▪️ 样本分装冻存,拒绝反复冻融!-80℃保存,一次一管 ▪️ 所有试剂提前30min平衡到室温,浓缩洗涤液结晶先37℃溶解 💧【试剂配制划重点】 ✅ 洗涤液:20×稀释到1×,现配现用 ✅ 生物素化抗体:用前20min稀释成1×工作液,当天用完 ✅ TMB显色液:A液+B液1:1混匀,避光!用前10min配好 ✅ 标准品梯度稀释:每一步都要涡旋混匀!否则曲线全歪 📋【操作流程速通版】 1.加样:标准品+样本各50μL/孔,37℃孵育40min 2.洗板×3次:拍干!拍干!拍干!洗涤不彻底是所有高背景的元凶 3.加生物素化抗体100μL/孔,37℃孵育30min 4. 洗板×3次 5.加SABC复合物100μL/孔,37℃孵育20min 6. 洗板×3次(这次尤其关键,SABC残留=高本底) 7. 加TMB混合液100μL/孔,37℃避光显色10-20min,看到S1孔变深蓝就终止 8. 加终止液100μL/孔,蓝色变黄色,立即450nm读板 📈【数据处理心机】 ✨ 双孔取均值,扣除Blank背景 ✨ 四参数逻辑拟合标准曲线,R²>0.99才合格 ✨ 样本OD值超出标曲范围,稀释重测,别硬套 ✨ 双孔CV<10%,超过要自查加样量和洗板操作 💡【避坑宝典】 ❗全孔无信号:检查是否漏加抗体或底物,试剂是否过期 ❗背景巨高:洗板次数不够,SABC没洗干净,TMB显色太久 ❗标曲线性差:标准品没混匀,倍比稀释时没换枪头 ❗边缘效应:孵育时封板膜没贴紧,避免把边缘孔当关键数据孔 上海威奥生物操作准则记牢这句话: “精准操作每一步,成就可靠检测结果。” #elisa #elisa实验 #ELISA #科研 #实验
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ChIP实验流程解析,导师不教也得会的必备技能! ChIP实验到底怎么做? 从细胞/组织样本,到拿到蛋白结合的DNA片段,中间要经过哪些关键步骤? 今天带你走一遍标准流程🧬 🔬 第一步:样本处理——不同来源,方法不同 • 细胞样本:约1x10⁷个细胞,收集后裂解 • 动物组织:3g以上,先研磨再裂解 • 植物组织:幼嫩叶片0.5g或根茎3-5g,液氮研磨 裂解缓冲液中记得加蛋白酶抑制剂,保护蛋白不被降解。 🧪 第二步:交联——把蛋白和DNA“锁”在一起 用1%甲醛室温处理10-15分钟,让蛋白和DNA“绑定”。 ⚠️ 时间别太长!过长会导致抗原表位被遮蔽,影响抗体识别。 交联完成后,加甘氨酸,终止反应。 ⚡ 第三步:超声打断——把染色质切碎 这一步很关键! 参考条件:功率50W或18%,开1秒/停1秒,总时长15分钟左右。 打断后目标片段大小: • ChIP-qPCR:200-700 bp • ChIP-seq:300 bp左右最佳 打断不均匀,后续免疫沉淀和数据分析都会受影响。 🎯 第四步:免疫沉淀——用抗体“钓”出目标 利用抗原-抗体特异性识别,将目的蛋白结合的DNA片段沉淀下来。 抗体质量是成败关键,务必选ChIP验证过的抗体。 📦 第五步:解交联与DNA提取 逆转交联,释放DNA片段,纯化后得到ChIP-DNA。 下一步:已知靶点做qPCR验证,全基因组范围探索做测序。 每一步都藏着影响结果的细节 掌握流程,让ChIP实验更顺利✨ #金开瑞 #生物 #实验 #科研 #实验室
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