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原核表达的原理蛋白质表达技术:将基因插入合适载体后导入宿主细胞用于表达大量蛋白质的方法。应用于蛋白质纯化、定位,蛋白质的结构域分析及蛋白质的体外功能分析等方面。原核表达系统:将外源基因导入原核细胞并使其表达蛋白质的技术。分为大肠杆菌表达系统,芽孢杆菌表达系统,链霉菌表达系统。步骤1.载体构建:把目的基因插入合适的原核表达载体,载体含启动子、终止子、复制原点等元件。启动子驱动基因转录,如常用的T7启动子。2.转化宿主菌:将重组载体导入原核宿主菌,如大肠杆菌。常用化学转化法或电转化法增加细菌细胞壁通透性,使载体进入。3.转录:宿主菌RNA聚合酶识别载体启动子,结合后启动目的基因转录,合成mRNA。4.翻译:mRNA与核糖体结合,tRNA携带氨基酸按密码子顺序合成多肽链,经折叠加工成有功能的蛋白质。5.诱导表达:添加诱导剂让目的基因高效表达,如IPTG可诱导含lac启动子载体的基因表达。优点我们常采用大肠杆菌表达系统,主要因为它的八大优势: 1.遗传背景清楚2.目的基因表达水平高3.培养周期短4.抗污染能力强5.更易于生长和控制6.实验技术相对简单7.成本廉价8.有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具有各种特性的质粒可供选择#干货分享 #知识分享 #生物实验室 #每天跟我涨知识 #科普一下
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为什么基因有显性和隐性之分?基因的显性和隐性之分本质上源于控制同一性状的不同等位基因在产生特定蛋白质(或其他功能分子)上的功能差异,以及生物体对这些蛋白质剂量的敏感度。 以下是更详细的解释: 基因与蛋白质的关系: 基因是DNA序列片段,包含制造特定蛋白质的指令。 大多数性状(如豌豆的圆滑/皱缩、人的头发颜色、某些酶的活性等)都是由一种或多种蛋白质的功能决定的。 等位基因的差异: 生物体的每对常染色体上,同一个基因有两个拷贝(等位基因),一个来自父亲,一个来自母亲。 这两个等位基因的DNA序列可能完全相同(纯合子),也可能存在细微差异(杂合子)。这种差异(突变)可能导致它们指令合成的蛋白质有所不同。 关键原因:功能蛋白的“剂量” 显性等位基因: 通常是一个能产生功能性蛋白质的等位基因。关键在于,在很多情况下,一个功能性基因拷贝(50%的正常蛋白量)就足以让细胞的特定生化途径正常工作,从而产生出该基因对应的“正常”或“优势”表型(性状)。 隐性等位基因: 通常是一个由于DNA序列变化(突变)而丧失了部分或全部功能的等位基因。它可能无法产生任何蛋白质,或者产生的蛋白质是功能不全的(比如酶活性很低、结构蛋白不稳定等)。 当只有一个隐性等位基因存在时(杂合子),另一个来自父本或母本的显性等位基因仍然可以产生足够量的功能蛋白,维持细胞生化途径的正常运作。因此个体不会表现出隐性性状,而表现出显性性状。 只有当成对的染色体上两个等位基因都是隐性的(纯合隐性)时,细胞才完全缺失有功能的那类蛋白(或者功能蛋白量低到临界值以下),此时隐性性状(通常是非正常的、缺陷的)才会表达出来。 举例说明:豌豆的圆滑与皱缩(孟德尔经典实验) 控制淀粉合成: 圆滑和皱缩的性状差异主要由种子中淀粉合成途径中的一个关键酶决定。 显性等位基因(R): 编码一个功能正常的酶,能有效地将糖类合成淀粉。 隐性等位基因(r): 发生了突变,不能编码功能酶或酶活性极低。 表型表达: RR(纯合显性): 有两个正常基因拷贝,产生足量功能酶,淀粉合成正常,种子饱满圆滑。 Rr(杂合): 有一个正常基因(R)和一个缺陷基因(r)。一个正常基因拷贝(R)产生的酶量通常就足以使淀粉合成途径正常运作到产生圆滑种子的程度。所以种子仍然是圆滑的。R(显性)掩盖了 r(隐性)的存在。 rr(纯合隐
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浅谈转录组和蛋白组的分析思路及差异 #润玥生物科技# 能否按照转录组的分析思路来进行蛋白组的分析? 一、核心前提:蛋白组与转录组的本质区别 理解二者的差异是分析基础:转录组得到的是“基因表达量”,而蛋白组得到的是“蛋白总丰度”…转录组更多回答“哪些基因被激活”,而蛋白组则回答“这些基因的产物如何影响细胞行为”。 二、分析思路的迁移:从转录组到蛋白组的核心逻辑 1、差异分析:从“基因表达量差异”到“蛋白功能状态差异” …蛋白组中,数据是连续型,可用t检验等线性模型;…除总蛋白丰度差异外,蛋白组更关注“实际功能的变化”(如某蛋白虽总丰度不变,但被修饰后活性增强)。 2、富集分析:从“基因集富集”到“蛋白功能模块富集” 在转录组中…,回答“哪些生物学过程被激活”。 而在蛋白组中,由于蛋白的功能注释覆盖度低于mRNA,…需结合结构域预测等补充;… 3、趋势分析:从“时间/条件依赖的表达模式”到“动态功能的演变轨迹” 在转录组中,通常通过时间序列聚类,…。 而在蛋白组中,蛋白的聚类还需结合“功能一致性”… 4、GSEA:从“基因排序”到“蛋白功能排序” 在转录组中,一般通过基因排序值…关联表型与功能模块。 而在蛋白组中,…需过滤低丰度蛋白或用最小非零值填充,避免高估差异,… 5、WGCNA:从“共表达模块”到“共功能模块” 在转录组中,通过基因共表达构建模块,识别核心调控基因。 在蛋白组中,共表达需结合“功能关联”,提高同一复合体或通路蛋白的相关性;最后的验证阶段,蛋白组模块需额外验证“功能协同性”(如Co-IP验证互作、免疫荧光验证共定位)。 三、为何有些文章更偏好做蛋白组? 1、关注“功能执行”而非“转录调控” 若目标是阐明“某表型如何发生”,…则可直接检测执行功能的蛋白。 2、转录组与蛋白组的相关性低:避免“伪阳性”干扰 若研究目标是筛选“真正影响表型的分子”,转录组可能引入大量“转录水平变化但功能无关”的假阳性,故需蛋白组验证功能状态。 3、技术互补性需求:转录组作为“初筛”,蛋白组作为“验证” 转录组常作为“初筛工具”,而蛋白组用于“验证功能”。… 润玥生物,拥有丰富高通量测序和多组学服务经验。提供基因组、微生物组、转录组、表观组、蛋白组、代谢组以及单细胞时空多组学的测序和分析,欢迎咨询~我们竭诚为您服务!
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