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提香8月前
1、P1中葡萄糖增加渗透压,促进细胞壁和细胞膜裂解,还有增大粘度,减少机械剪切力,防止DNA 断裂并保证菌体不至于快速沉降而悬浮的作用;EDTA是螯合剂,与金属离子结合,尤其是钙镁离子,而它们俩也是细胞膜的重要成分,对胞内酶的活性很重要,且细胞壁最外层是LPS,带负电荷,其稳定性与足够多的钙离子相关,所以EDTA螯合掉Ca2+会使LPS解体,暴露出内层的肽聚糖,同时破坏细胞膜,抑制胞内酶活性,如核酸酶,降低DNase对DNA的降解。 2、P2中NaOH与SDS可裂解细胞壁,释放细胞内容物,并使DNA、蛋白变性并形成交联网状结构而沉淀,在这个过程中,chromosomal DNA会被降解成线性片段,强碱条件下发生变性分离变成单链,但plasmid DNA相对耐受,仍以双链形式存在。最后下一步的沉淀可以通过离心去除。所以碱性需要适度,不能太强了,即这步也不能时间太长,没必要静置,也不要剧烈震荡,可能导致断裂的基因组DNA碎片很可能会和质粒混在一起; 3、P3中醋酸钾缓冲液主要是中和NaOH,且醋酸钾与SDS作用,反应生成十二烷基硫酸钾并带动蛋白质沉淀,高浓度的盐溶液加上高速离心可以让SDS-protein-chromosomal DNA复合物以及细胞裂解物等沉淀析出,而plasmid DNA溶解在上清中,因为闭环质粒可以复性,但DNA不能复性; 4、wash buffer主要是清洗掉多余的盐离子,因为plasmid DNA会吸附在柱子或者磁珠上,然后用70%乙醇把盐洗掉,再用水把plasmid DNA从柱子上洗脱下来就可以了,所以可以用移液枪环绕吸附柱冲洗,而有时候洗液里的乙醇会影响后续的酶切或测序反应,所以要空柱离心和彻底蒸发乙醇; 5、配方不同,用的柱子也不同,大概要看一下使用的试剂盒。有的试剂盒就没有葡萄糖,有的就挪动了胍盐,有的有盐酸胍,有的Tris base和Tris HCl混合调整缓冲,或者调整了EDTA二钠,有的是醋酸钠而不是醋酸钾,很多情况都有可能,而看并记熟流程,再一气呵成快速操作是肯定没错的。
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