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流式细胞术实验过程+上机流程(视频版🔥 流式细胞术(Flow Cytometry)是一种对悬浮在流体中的微小颗粒进行技术和分选的实验方法。可以检测细胞表面或细胞内分子的表达情况、鉴定和分离不同细胞类型等。 今天我们一起来看一下流式细胞术的实验过程+上机流程吧~ ✅制备单细胞悬液 细胞样品可以直接用刮刀刮下来,组织样品需要剪成小块后用活塞研磨,最后通过200目滤网过滤得到单细胞悬液。 ✅流式抗体染色 今天用的是爱博泰克的Mouse T Cells Panel,直接配色一套使用比较方便,T细胞分群结果也很明显。ABclonal是利用SMab®重组兔单抗技术,开发的ABflo®系列全新兔单克隆流式抗体特异性高、灵敏度高、批次间稳定性好,还有极高的信噪比。 ⚠️需要注意流式上机时设置blank组、单阳组和FMO对照。 Blank就是空白对照或未染色细胞组(不加抗体染色)。 单阳管即单染对照,单阳管可以用细胞,也可以用补偿微球,但是不能混合一管染,细胞也最好是跟样本接近的类型,不要两种相差很大的细胞混合在一起做,如药物处理和未处理的细胞混合做单染 FMO对照(荧光扣除对照,抗体减一对照),建议低表达或连续表达的靶点设置该对照 ✅上机流程 执行完开机流程后,依次上阴性管、单阳管和FMO管,按照文献或者爱博泰克抗体说明书的图圈门和调补偿(防止不同抗体串光)。之后检测实验组即可~ 🔥注意:全程在冰上进行,抗体染色及之后步骤需要避光 #poppy的科研生活 #细胞实验 #流式细胞术 #爱博泰克 #ABclonal
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周周4天前
双荧光素酶检测实验流程 一、实验准备材料 1、细胞株 根据研究目的选择合适细胞,提前复苏、传代培养。 2、质粒 含目的基因启动子或3'-UTR序列的萤火虫荧光素酶报告基因质粒,海肾荧光素酶表达质粒(内参)。 3、转染试剂 如Lipofectamine 3000等。 4、细胞培养相关试剂 DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液。 5、耗材 双荧光素酶检测试剂盒、6.96孔白色细胞培养板、无菌枪头、离心管等。 6、仪器 CO₂培养箱,设置为37℃、5%CO₂、超净工作台、酶标仪(具备检测荧光素酶活性功能)、离心机。 二、实验步骤细胞接种 1、实验前1天,将处于对数生长期细胞用胰蛋白酶消化,用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬,计数。 2、以每孔5×10³-1×10⁴个细胞密度接种到96孔白色细胞培养板,每孔加100μL培养基,轻轻混匀,避免产生气泡。 3、将培养板放入培养箱,培养过夜,使细胞贴壁且融合度达50%-70%。 三、转染 1、准备2个无菌离心管,按转染试剂说明书操作。一管中加入50μL无血清培养基,再加入适量萤火虫荧光素酶报告基因质粒和海肾荧光素酶表达质粒(两者比例通常为10:1,根据实验优化);另一管加50μL无血清培养基和适量转染试剂,轻轻混匀,室温孵育5分钟。 2、将两管液体混合,轻轻颠倒混匀,室温孵育20分钟,形成DNA-转染试剂复合物。 3、从培养箱取出细胞培养板,吸去原培养基,用PBS轻轻洗涤细胞2次。 4、每孔加入100μL含DNA-转染试剂复合物的无血清培养基,放入培养箱培养4-6小时。 5、4-6小时后,吸去含转染复合物培养基,每孔加入150μL完全培养基,继续培养24-48小时。 四、双荧光素酶活性检测 1、从培养箱取出96孔板,将其平衡至室温。2.按照双荧光素酶检测试剂盒说明书,在每孔加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂,轻轻混匀,室温孵育2-3分钟。 2、立即用酶标仪检测萤火虫荧光素酶活性,记录发光值。 3、检测完萤火虫荧光素酶活性后,每孔加入100μL海肾荧光素酶检测试剂,轻轻混匀,室温孵育2-3分钟。 4、用酶标仪检测海肾荧光素酶活性,记录发光值。 五、结果分析 1、计算每孔萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值(Firefly/Renilla),以消除转染
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试验设计与统计分析 试验设计与统计分析是现代科学研究中不可或缺的方法论体系,其核心在于通过科学规划实验流程和严谨分析数据,揭示现象背后的规律。试验设计的科学体系起源于20世纪20年代费希尔的农业试验研究,其三大基本原则至今仍是研究设计的黄金准则:随机化、重复和区组化。随机化能有效消除系统误差,确保各组可比性;重复试验则通过增加样本量提高结果可靠性;区组化则针对已知干扰因素进行分层控制。现代试验设计已发展出丰富的方法体系,包括完全随机设计、随机区组设计、拉丁方设计等传统方法,以及响应面法、正交设计等优化技术。 统计分析方法与试验设计存在天然耦合关系。参数检验中的t检验、方差分析适用于正态分布数据,非参数检验如Wilcoxon秩和检验则应对非正态分布。多元统计分析中的主成分分析、聚类分析能处理高维数据,而回归分析(线性/非线性)则揭示变量间因果关系。贝叶斯统计的引入为小样本研究提供了新思路,机器学习算法则拓展了复杂模式识别的能力。值得注意的是,选择统计方法必须与试验设计类型匹配,例如裂区设计需采用混合效应模型,重复测量数据则需考虑时间相关性。 在农业科研领域,某水稻品种比较试验展示了完整的方法应用链。研究者采用随机区组设计,设置3个品种×5个重复共15个小区,通过控制土壤肥力梯度形成区组。收获后数据经方差分析显示:品种间产量差异显著(F=8.35,p<0.01),进一步Duncan多重比较确定最优品种。该案例中,科学的区组划分消除了土壤异质性干扰,而恰当的统计方法则准确识别了品种效应。 医药研发中的临床试验更具方法学挑战。双盲随机对照试验(RCT)是评价新药疗效的金标准,其设计要点包括:计算满足检验效力的样本量、采用区组随机保证组间平衡、设置安慰剂对照。食品工业中的响应面优化案例同样典型。在开发低糖饼干配方时,研究者采用中心复合设计考察成分因素对感官评分的影响。通过二次多项式模型拟合,找出最佳配比。 展望未来,随着精准医学、智能制造的推进,试验设计将更强调个体化响应建模和实时过程优化。统计分析方法则需要适应边缘计算环境下的流数据分析,开发更强大的高维数据降维工具。无论技术如何演进,科学问题的准确界定、研究设计的严谨规划、数据分析的客观解释,始终是产生可靠结论的基石。研究者应当既避免"统计万能主义"的陷阱,也不陷入"数据恐惧症"的窠臼,在方法创新与实用主义之间保持平衡。
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