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质粒小题实操 ✅本篇使用的是天根的质粒小提试剂盒,不同试剂盒的试剂名称不太一样,但是原理和作用基本相同(碱裂解法)。 🌟P1:悬浮液。成分:Tris-HCl、EDTA RNase A (需要4℃保存)。Tris-HCl 能够提供稳定的pH环境。EDTA作为二价金属离子螯合剂,能螯合Mg²⁺、Ca²⁺等离子,抑制DNase的活性,防止质粒DNA被降解。RNase A能够降解样品中的RNA,避免RNA污染后续的质粒样品。 🌟 P2:裂解液。成分:NaOH和SDS。NaOH作为强碱,SDS作为阴离子去污剂能够裂解细菌细胞壁、在细胞膜上穿孔,释放细胞内的质粒。 🌟 P3:中和液。成分:醋酸钾 (KAc)和醋酸 (HAc)。中和溶液P2的强碱性,加入钾离子来置换SDS的钠离子,以形成不溶的PDS,带动蛋白质、基因组DNA共沉淀。 🌟PD:去蛋白液。成分:通常含有高浓度的盐酸胍或异硫氰酸胍。在高盐环境下,带负电的DNA和带正电的硅胶膜作用达到最强,促进DNA结合到硅胶膜上。同时高浓度的盐酸胍本身是一种蛋白质变性剂,它可以使蛋白质变性、沉淀。在促进结合的同时,也附带去除了一部分蛋白质。 🌟PW:漂洗液。成分:含有乙醇的盐溶液。洗涤和脱水。在DNA结合到硅胶膜上之后,用PW进行漂洗,可以去除残留的蛋白质、盐离子等杂质。 🌟EB:洗脱液。成分:10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 或无菌去离子水。低离子强度和微碱性的环境能削弱DNA与硅胶膜之间的相互作用,从而将质粒DNA洗脱下来。 🌟BL:平衡液。成分:高浓度的离液盐如盐酸胍或异硫氰酸胍。创造一个高盐、离液的环境,促进DNA与硅胶膜(纯化柱)的特异性结合。 🌟详细操作步骤见上图 # #质粒构建#研究生日常 #科研小白 #生物实验#实验室日常
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