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原核质粒构建全流程 科研小白进阶 | 原核质粒构建全流程干货宝子们,原核质粒构建在基因研究领域超重要!今天就来把这个实验的门道给大家讲清楚~ 🎯 实验目的 咱们搞原核质粒构建,就是为了把目的基因送进原核细胞(像大肠杆菌) ,实现基因克隆、表达,研究基因功能。有了构建好的原核质粒,后续蛋白制备、基因功能验证、药物研发实验才有基础! 🧫 实验步骤 1. 目的基因的获取 - 设计引物:用Snapgene设计特异性引物,引物两端加酶切位点和保护碱基,方便和载体“牵手”。 - PCR扩增:以含目的基因的DNA为模板,模板、引物、dNTP等组成反应体系,按94℃预变性、94℃变性、55 - 65℃退火、72℃延伸的程序,循环30 - 35次,最后72℃再延伸10分钟,把目的基因“扩”出来。 - 琼脂糖凝胶电泳检测:看看PCR产物条带对不对,条带单一且大小符合预期,才能接着往下做。 2. 载体的选择与处理 - 选择合适的载体:像pET系列、pGEX系列这些原核表达载体,有复制起始位点、筛选标记、启动子等元件,按需选。 - 载体酶切:用和目的基因两端一样的酶切载体,37℃酶切1 - 3小时甚至过夜,再电泳看看切得咋样。 3. 目的基因与载体的连接 把酶切后的目的基因和载体按3 - 10 : 1摩尔比混合,加T4 DNA连接酶和连接缓冲液,16℃连接过夜,不放心就电泳检测连接产物。 4. 转化 - 制备感受态细胞:用氯化钙法把大肠杆菌培养到对数生长期,再用冰冷氯化钙溶液处理,让细胞能“抓住”外源DNA。 - 转化反应:连接产物加进感受态细胞,冰浴、热激、再冰浴,加LB培养基复苏。 5. 筛选阳性克隆 - 涂板筛选:把转化后的细胞悬液涂在含抗生素的LB平板上,能长菌落的就是成功转化重组质粒的。 - 菌落PCR筛选:挑单菌落到含抗生素LB液体培养基,以菌液为模板PCR扩增,电泳看能不能扩出目的条带。 - 酶切鉴定:对初步筛出的阳性克隆提质粒,用构建时的限制性内切酶酶切,电泳分析产物。 6. 测序验证 送酶切鉴定的阳性克隆去测序,和原始序列比对,一致就说明原核质粒构建成功啦! 💡 小提示 整个过程无菌操作超重要,试剂配制也得精准,这样实验结果才靠谱~科研er们赶紧码住,实验顺利冲! #原核质粒构建实验#论文 #科研学习#科研干货 #生物实验
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